З клінічної біохімії (для студентів фармацевтичного факультету 4 курсу спеціальності «Клінічна фармація»)



Сторінка9/14
Дата конвертації05.11.2016
Розмір2.51 Mb.
1   ...   6   7   8   9   10   11   12   13   14

А. Ліполізу


В. Кетогенезу

С. Глікозилювання білків

D. Протеолізу білків

Е. Глюконеогенезу


4. При дослідженні крові у хворого виявлена виражена гіпоглюкоземія натщесерце. При дослідженні біоптату печінки виявилось, що в клітинах печінки не відбувається синтез глікогену. Недостатність якого фермента є причиною захворювання?

А. Піруваткарбоксилази


В. Фосфорилази

С. Альдолази

D. Фруктозодифосфатази

Е. Глікогенсинтетази

5. У немовляти відмічається блювання і пронос, загальна дистрофія, гепато- і спленомегалія. При припиненні годування молоком симптоми зменшуються. Який основний спадковий дефект буде відмічатися в патогенезі?

А. Порушення обміну тирозину


В. Недостатність глюкозо-6-фосфатдегідрогенази

С. Порушення обміну галактози

D. Порушення обміну фенілаланіну

Е. Гіперсекреція залоз зовнішньої секреції

6. У хворого судоми в м’язах при напруженій фізичній праці, у стані спокою почуває себе здоровим. При біопсії м’язової тканини виявлено великий надлишок глікогену. Концентрація глюкози у крові нижча від норми. Про недостатність якого ферменту слід думати?


  1. Глюкозо-6-фосфатази

  2. Тирозинази

  3. Галактокінази

  4. Глюкозо-6-фосфатізомерази

  5. Фенілаланін-4-монооксигенази

7. Вкажіть можливі причини виникнення цукрового діабету І типу:

А. Ожиріння

В. Вірусне ураження -клітин

С. Травма підшлункової залози

D. Психічна травма

Е. Аутоімунне ураження острівців Лангенгарса з розвитком інсуліту

8. Хворий після перенесеного ендемічного паротиту схуднув, постійно відчуває спрагу, п'є багато води, відмічає часте сечовиділення, підвищений апетит, шкірний свербіж, слабкість, фурункульоз. У крові : глюкоза – 16ммоль/л, кетонові тіла – 100мкмоль/л, глюкозурія. Яке захворювання розвинулося у пацієнта?

А. Стероїдний діабет

В. Інсуліннезалежний цукровий діабет

С. Нецукровий діабет

D. Інсулінзалежний цукровий діабет

Е. Гострий панкреатит

9. До лікаря звернулась мати з приводу поганого самопочуття дитини: поганий сон, відсутність апетиту, дратівливість. При біохімічному дослідженні виявлено відсутність глюкоцереброзидази. Для якої патології це характерно?

А. Хвороба Тея – Сакса

В. Хвороба Гірке

С. Хвороба Німана – Піка

D. Хвороба Гоше

Е. Хвороба Помпе

10. Дитина 1-го року відстає в розумовому розвитку від своїх однолітків. Ранком відзначаються блювання, судоми, непритомність. У крові гіпоглікемія натще. З дефектом якого якого ферменту це пов'язано?

А. Сахарози

В. Аргінази

С. Фосфорилази

D. Глікогенсинтази

Е. Лактази


Ситуаційні задачі


1. Хвору привезено каретою швидкої допомоги. Стан важкий, свідомість затьмарена, адинамія, тахікардія, запах ацетону з рота. Про наявність якої патології це свідчить? Які додаткові обстеження доцільно призначити?

2. У хворих з пониженою активністю глюкозо-6-фосфатдегідрогенази в еритроцитах спостерігається підвищена чутливість до окиснювачів, а також порушується відновлення метгемоглобіну. Яка причина такого стану?

3. У здорових людей після цукрового навантаження вміст глюкози в крові може зменшуватися. Поясніть чому це відбувається.

4. У сечі виявлено 3,6 % глюкози. Які біохімічні дослідження необхідно провести , щоб відрізнити ниркову глюкозурію від діабетичної?

5. Вміст глюкози в крові становить 3,0 ммоль/л. Як називається такий стан і які можуть бути наслідки?

Індивідуальна самостійна робота студентів

Теми для реферативних доповідей:


  1. Ферменти обміну вуглеводів в ензимодіагностиці.

  2. Використання гормонів (інсуліну, адреналіну, глюкокортикоїдів) як лікарських засобів.

  3. Використання негормональних цукрознижуючих препаратів для лікування цукрового діабету.

  4. Спадкові порушення обміну глікогену в людини.

  5. Метаболічні порушення при цукровому діабеті.

  6. Методи діагностики та принципи біохімічної корекції цукрового діабету.


Література

1.Біологічна хімія /Вороніна Л.М., Десенко В.Ф., Мадієвська Н.М. та ін. //Харків: Основа;

Видавництво НФаУ, 2000.- С. 241 -277.

2. Биомолекулы – фармпрепараты / Воронина Л.Н., Волощенко М.В., Загайко А.Л. и др. // Харьков: НФаУ, 2008. – С. 48 – 57.

2. Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі / За ред. О.Я. Склярова. – К:, «Медицина» 2010. – С. 62 – 84.

3. Біологічна хїімія з біохімічними методами дослідження: підручник / О.Я. Скляров, Н.В. Фартушок, Л.Д. Сойка, І.С. Смачило. – К.: Медицина, 2009. – С.196 – 231.

3.Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ; Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – С. 163-188.

4. Клінічна біохімія / За ред. О.Я. Склярова. – К.: Медицина, 2006.- С 56 – 62, 84, 108.

5. Клиническая биохимия: Учебник для студентов мед.вузов / А.Я. Цыганенко, В.И. Жуков, В.В. Леонов и др. – Харьков: Факт, 2005. – 456 с.

6. Практикум з біологічної хімії / За ред. проф. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. – С. 107 – 118.

7. Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике. – Минск.: Беларусь, 2000. – Т.2.- С. 10-104.

8. Клиническая биохимия / Цыганенко А.Я., Жуков В.И., Мясоедов В.В. и др.– М.: Триада-Х, 2002. – С. 163 – 196.

10. Amiel S. A. Human insulin in hypoglicemia // Diabetes.- 1995.- v.44, №3.-P.257-260.

11. Froguel P. Genetics of type I insulin - dependent diabetes mellitus // Horm. Reser.- 1997.- v.48, № 4.- P. 55-57.



Тема 4. КЛІНІКО-БІОХІМІЧНА ОЦІНКА ПОРУШЕНЬ ЛІПІДНОГО ОБМІНУ

Мета заняття: Знати основи класифікації, будову, основні фізико-хімічні властивості, функції ліпідів, їх роль у патохімічних процесах організму. Вміти визначати вміст: тригліцеридів та холестерину у сироватці крові та оцінити їх клініко-діагностичне значення.

Актуальність теми: У живому організмі, ліпіди виконують різноманітні функції: вони є складовими компонентами біологічних мембран, приймають участь в регуляції проникності, є енергетичним джерелом, виконують пластичну функцію, а також є попередниками біологічно активних речовин (простагландини). Тому знання клінічними фармацевтамим будови та фізико-хімічних властивостей і процесів патології обміну ліпідів, вміння визначати і оцінювати порушення кількісного складу жирів, співвідношення різних фракцій ліпідів у крові є необхідним для формування у студентів уявлення про функціонування клітини та організму в цілому при патолічних процесах.

Конкретні завдання:

  • Вміти якісно виявляти жовчні кислоти у біологічних рідинах.

  • Проводити кількісне визначення фосфоліпідів та холестерину у сироватці крові.

  • Аналізувати та оцінити одержані дані для розуміння ролі ліпопротеїнів у розвитку патологічних процесів.


Теоретичні питання

  1. Біохімічні основи порушення перетравлення та всмоктування ліпідів при патології органів травної системи.

  2. Будова та принципи класифікації ліпопротеїнів плазми крові. Ліпід-переносимі білки. Модифіковані форми ліпопротеїнів.

  3. Дисліпопротеїнемії. Клініко-біохімічна характеристика різних типів гіпер- та гіпопротеїнемій. Принципи лабораторної діагностики дисліпопротеїнемій.

  4. Ожиріння, патохімія, діагностика. Жирове переродження клітин печінки та м’язів. Шляхи їх корекції.

  5. Порушення обміну холестерину. Гіперхолестеринемія та її причини.

  6. Біохімічні основи порушення обміну ліпідів при атеросклерозі. Корекція патохімічних процесів при розвитку атеросклерозу різного ступеню.

  7. Порушення ліпідного обміну при жовчекам’яній хворобі та його корекція фармпрепаратами.

  8. Процеси пероксидного окиснення ліпідів у патогенезі різних захворювань, їх оцінка.

  9. Механізм антиоксидантного захисту, інтерпретація даних. Застосування природніх і штучних антиоксидантів у клінічній практиці.

  10. Порушення внутрішньоклітинного обміну ліпідів. Вроджені порушення обміну ліпідів – ліпідози.

Блок інформації

Ліпопротеїни (ЛП) – це клас складних білків, простетичною групою яких є ліпіди. Білковий компонент зв’язується з ліпідами нековалентними чи іонними зв’язками. Плазменні ЛП мають характерну будову: всередині ЛП-частинки знаходиться ядро (жирова крапля), яка містить неполярні ліпіди (триацилгліцероли, етерифікований холестерин). Ядро оточене оболонкою, до складу якої входять фосфоліпіди, білок і вільний холестерин. Білки з полярними ліпідами формують поверхневий гідрофільний шар, який оточує і захищає внутрішню гідрофобну ліпідну сферу від водного середовища і забезпечує транспорт ліпідів у кров’яному руслі та доставку їх в органи. Товщина зовнішньої оболонки ліпопротеїдної частки складає 2,1 2,5 нм, що відповідає половині товщини ліпідного бішару клітинних мембран. До ЛП відносять тромбопластичний білок тканини легень, ліповітелін жовтка курячого яйця, деякі фосфоліпіди молока, а також вони беруть участь в структурній організації мієлінових оболонок нервів, хлоропластів, фоторецепторної та електронотранспортної системи паличок і колбочок.

Існує кілька класифікацій ЛП. Класифікація заснована на різниці в їх щільності, яка залежить від вмісту в них ліпідів: хіломікрони (ХМ), ЛПДНЩ, ЛПНЩ і ЛПВЩ.



Хіломікрони – найбільші ЛП і складаються в основному з триацилгліцеролів, оточених тонким шаром білків. Вони переносять триацилгліцероли з тонкої кишки у печінку.

ЛПДНЩ – синтезуються в печінці і також виконують транспортну функцію. У їх складі виявлені фосфоліпіди і холестерол. ЛПДНЩ, які не попали у жирову тканину перетворюються у ЛПНЩ, у яких вміст ефірів холестеролу зростає до 45%. Їх роль полягає у переносі холестерину до периферичних тканин і регуляції синтезу холестеролу de novo.

ЛПВЩ – синтезуються в печінці, багаті на фосфоліпіди і холестерол. Вони здійснюють транспорт холестеролу від периферичних тканин до печінки.

Білкові компоненти ЛП мають назву аполіпопротеїни (апоЛП) і відносяться до 8 типів апобілків: апоА-І, апоА-ІІ, апоВ, апоС-І, апоС-ІІ, апоС-ІІІ, апоД, апоЕ. Вони відіграють важливу роль у підтриманні структурної цілісності ЛП, регуляції активності ферментів, які діють на ЛП, впізнаванні ЛП рецепторами. АпоВ зустрічається у двох формах – більшій за розмірами апоВ100 і апоВ48, яка складає 48% від молекулярної маси апоВ100. АпоВ100 – це основний апоЛП ЛПНЩ, тоді як апоВ48 зустрічається тільки у хіломікронах. Обидва білки кодуються однаковим геном, проте мРНК для апоВ у кишечнику менше. Це, очевидно, пов’язане з ферментативною зміною нуклеотидних основ у кишечній мРНК, що призводить до утворення стоп-кодону. Визначають три ізоформи апоЕ – Е2, Е3 і Е4, кожна з яких кодується своїм геном. Існує шість можливих фенотипів Е2/Е2, Е2/Е3, Е2/Е4, Е3/Е3, Е3/Е4, Е4/Е4.



Дисліпопротеїнемії – це зміни в складі ЛП плазми крові, які характеризуються їх підвищенням, зниженням чи практично повною відсутністю, а також наявністю у крові нетипових чи патологічних ЛП. Під терміном гіперліпопротеїнемії розуміють підвищення рівня певних класів ЛП у плазмі крові. Гіперліпопротеїнемії можуть бути первинні – пов’язані зі спадковою патологією і вторинні, які виникають на фоні захворювань внутрішніх органів. Розрізняють наступні типи дисліпопротеїнемій:

Тип І – гіперхіломікронемія. Основні зміни у ліпопротеїнограмі наступні – зростає вміст хіломікронів, різко підвищується рівень тригліцеридів в сироватці крові, нормальний чи дещо підвищений вміст ЛПДНЩ, загальний холестерин, холестерин -ЛП, пре-ЛП і -ЛП – в межах норми. Коефіцієнт атерогенності у межах норми. Клінічно такий стан виявляється ксантоматозом – множинними ксантомами, які являють собою випуклі утвори на шкірі величиною від головки булавки до лісового горіха спочатку оранжевого кольору, а потім солом’яно-жовті. Супутніми захворюваннями є панкреатит, цукровий діабет. Сироватка крові відразу після взяття має молочновидний характер, різко хілезна. Після відстоювання протягом доби у холодильнику над сироваткою спливають хіломікрони, утворюючи кремоподібний шар, під яким сироватка залишається прозорою.

Тип ІІ – поділяють на тип ІІа – гіпер-ліпопротеїнемія, яка характеризується високим вмістом в крові ЛПНЩ, і тип ІІб – гіпер- та гіперпре-ліпопротеїнемія, яка вирізняється високим вмістом в крові одночасно двох класів ЛП – ЛПНШ і ЛПДНЩ. Клінічно тип ІІ супрорводжується атеросклеротичними порушеннями, часто розвивається ішемічна хвороба серця.

При підтипі ІІа сироватка крові після взяття і відстоювання 24 години у холодильнику прозора. Біохімічно визначають значно підвищену концентрація загального холестерину і холестерину -ЛП, яка однак по відношенню до загальної маси -ЛП не перевищує межі норми (45% від всієї маси -ЛП). Тригліцериди, холестерин пре-ЛП і -ЛП – у межах норми. Коефіцієнт атерогенності збільшений.



При підтипі ІІб сироватка крові відразу після взяття злегка мутна чи опалесціююча, після відстоювання 24 години у холодильнику характер мутності не змінюється. Біохімічно досліджується значно вища концентрація загального холестерину, холестерину -ЛП, незначно збільшена концентрація тригліцеридів і холестерину пре-ЛП, холестерин -ЛП – у межах норми. Коефіцієнт атерогенності підвищений.

Тип ІІІ – дис-ліпопротеїнемія. У сироватці крові з’являються ЛП з надзвичайно високим вмістом холестерину і високою електрофоретичною рухомістю (ЛППЩ), яких немає у здорової людини. Вони нагромаджуються в крові внаслідок порушення перетворення ЛПДНЩ у ЛПНЩ. Вміст холестерину по відношенню до загальної маси -ЛП значно перевищує верхню межу норми (45%). Це можна встановити доповнивши ліпідограму дослідженням -ЛП за методом Бурштейна-Самай. При візуальній оцінці сироватка крові відразу після її взяття може мати незначну мутність, характер її не змінюється після добового відстоювання у холодильнику. Біохімічно визначають значно підвищену концентрацію загального холестерину і холестерину -ЛП, незначно збільшена концентрація тригліцеридів і холестерину пре-ЛП, холестерин -ЛП – у межах норми. Коефіцієнт атерогенності збільшений. Цей тип часто супроводжують різні прояви атеросклерозу, в тому числі ішемічною хворобою серця і ураженням судин нижніх кінцівок.

Тип ІV – гіпер пре-ліпопротеїнемія. Характерне підвищення рівня ЛПДНЩ, нормальний вміст ЛПНЩ, відсутність хіломікронів, збільшення рівня тригліцеридів при нормальному чи незначно підвищеному рівні холестерину, холестерин -ЛП у нормі, коефіцієнт атерогенності в межах норми чи незначно підвищений. Сироватка крові після взяття мутна, аж до хілезної. Після 24-годинного відстоювання у холодильнику характер мутності не змінюється. Клінічно цей тип може спостерігатися при діабеті, ожирінні, ішемічній хворобі серця, атеросклерозі.

Тип V – гіперпре-ліпопротеїнемія і гіперхіломікронемія. Спостерігається підвищення рівня ЛПДНЩ, тригліцеридів, наявність хіломікронів. Загальний холестерин, холестерин - і -ліпопротеїнів – у межах норми. Коефіцієнт атерогенності в нормі чи незначно підвищений. Сироватка крові після взяття має молочновидний характер, різко хілезна. Після відстоювання у холодильнику у сироватці спливає кремоподібний шар хіломікронів, під яким сироватка залишається мутною. Клінічно проявляється ксантоматозом, збільшенням печінки та селезінки, панкреатитом, іноді поєднується з прихованим діабетом. Ішемічна хвороба серця і атеросклероз при цьому типі не спостерігаються.

Принципи лабораторної діагностики дисліпопротеїнемій. Основним біологічним матеріалом, який застосовують для біохімічної діагностики порушень обміну ліпідів, є кров. Головними ліпідними компонентами крові є холестерин та його ефіри, триацилгліцерини, фосфоліпіди, неетерифіковані жирні кислоти (НЕЖК). Ліпіди нерозчинні у воді, тому три перші класи присутні лише в складі ліпопротеїнів (ЛП), які утворюють стійкі колоїдні розчини і за багатьма властивостями подібні до білків. НЕЖК головним чином адсорбовані на альбуміні.

Холестериновий коефіцієнт атерогенності (К) визначають як відношення холестерину ЛПНЩ і ЛПДНЩ до холестерину ЛПВЩ:

К = (холестерин ЛПНЩ + холестерин ЛПДНЩ) / холестерин ЛПВЩ.

У клініці розраховують цей коефіцієнт на основі визначення загального холестерину і холестерину ЛПВЩ:

К = (загальний холестерин + холестерин ЛПВЩ) / холестерин ЛПВЩ.

Дослідження показали, що у хворих ішемічною хворобою серця вміст -ліпопротеїнового холестерину нижчий, ніж у здорових (1-2 ммоль/л). Номальними величинами вмісту холестеролу ЛПВЩ для мужчин є 1,15 1,30 ммоль/л (40-60 мг/дл), для жінок – 1,30–1,55 ммоль/л (50-60 мг/дл). Холестерин ЛПВЩ виявився у 8 разів чутливішим, ніж холестерин ЛПНЩ. Чим вищий коефіцієнт атерогенності К, тим вища ймовірність розвитку ішемічної хвороби серця. У новонароджених цей показник не перевищує 1, у осіб віком 20-30 років варіює в межах 2-2,8, а у здорових осіб старших 30 років без клінічних ознак атеросклерозу складає 3,0-3,5.



ПРАКТИЧНА РОБОТА

Диференційна діагностика гіперпротеїнемій (визначення холестеролу і триацилгліцеридів).

Для встановлення типу гіперліпопротеїнемії у лабораторії проводять візуальне та біохімічне дослідження сироватки крові пацієнта. Візуально сироватку оцінюють на наявність муті відразу після забору крові та через 24 години відстоювання у холодильнику. Біохімічно проводять комплекс тестів, об’єднаних у ліпідограму, які містять тригліцериди, загальний холестерин, холестерин -ліпопротеїдів. На основі цих тестів за формулами розраховують показники, які характеризують концентрацію холестерину -ліпопротеїнів, пре--ліпопротеїнів і коефіцієнт атерогенності. Такий підхід є достатнім для встановлення типу порушення ліпідного обміну.



Дослід 1. Кількісне визначення тригліцеридів у сироватці крові за кольоровою реакцією з ацетилацетоном.

Принцип методу. Тригліцериди екстрагують з сироватки крові сумішшю гептану та ізопропанолу, а фосфоліпіди при цьому залишаються у водній фазі. Звільнений у результаті лужного гідролізу тригліцеридів гліцерин окислюють до формальдегіду метаперйодатом натрію. Формальдегід утворює з ацетилацетоном забарвлену сполуку (3,5-диацетил-1,4-дигідролутидин), інтенсивність якого пропорційна концентрації тригліцеридів.

Матеріальне забезпечення: Гептан, ізопропіловий спирт, сірчана кислота 0,04 М, КОН, 5% оцтова кислота, перйодатний реактив, амоній оцтовокислий (рН 8,6), ацетилацетоновий реактив, розчин триолеїну 2,3 ммоль/л.

Хід роботи.

Компоненти

Дослідна проба, мл

Стандартна проба, мл

Холоста проба, мл

Сироватка

Вода дистильована

Стандартний розчин

Гептан


Ізопропіловий спирт

Сірчана кислота 0,04 моль/л



0,5



2

3,5


1

0,5


0,5

2

3,5



1

0,5


2

3,5



1

Перемішують 20 с, залишають стояти 5 хв., центрифугують 10 хв.

Верхній шар рідини

Ізопропіловий спирт

Розчин КОН


0,4

2

1 крапля



0,4

2

1 крапля



0,4

2

1 крапля



Перемішують 15 с, нагрівають на водяній бані при 70С 10 хв. і після охолодження додають

Перйодатний реактив

Ацетиацетоновий реактив



0,2

1,0


0,2

1,0


0,2

1,0


Нагрівають 10 хв. на водяній бані при 70С і відразу вимірюють у кюветі 5 мм при довжині хвилі 400-500 нм (синій світлофільтр) проти холостої проби.

Розрахунок проводять за формулою:

концентрація тригліцеридів (ммоль/л) = Едосл Ск / Ек,

де Едосл – екстинкція дослідної проби; Ек – екстинкція стандартної проби; Ск – концентрація стандартного розчину.

Зробити висновок. Пояснити отриманий результат. Звернути увагу на те, що пробірки порвинні бути обезжиреними попереднім споліскуванням ізопропанолом.

ЗНАЧЕННЯ ДЛЯ ФАРМАЦІЇ ТА КЛІНІКИ

Вміст тригліцеридів у сироватці крові коливається в межах 0,55– 1,65 ммоль/л. Верхня межа норми залежить від віку, статі, способу життя. Зростання вмісту тригліцеридів у сироватці крові визначають при нефротичному синдромі, гіпотиреозі, вагітності, жировій інфільтрації печінки, панкреатиті, алкоголізмі.



Дослід 2. Кількісне визначення холестерину у сироватці крові.

І. Визначення визначення загального холестерину у сироватці крові колориметричним методом.

Принцип методу. Холестерин за присутності оцтового ангідриду і суміші оцтової і сульфатної кислот утворює сполуку зеленого кольору. Кількість холестерину визначають за інтенсивністю зеленого забарвлення методом колориметрії.

Матеріальне забезпечення: сироватка крові, реактив №1 (суміш крижаної оцтової кислоти, оцтового ангідриду, концентрованої сульфатної кислоти 1:5:1). Суміш готують на холоді. Сульфатну кислоту додають в останню чергу, по краплях, постійно перемішуючи. Одержана суміш повинна бути безколірною або злегка жовтуватою. Зберігати в холодильнику в темному посуді з притертим корком; стандартний (1,8 г/л) розчин холестерину зберігати в холодильнику. ФЕК, пробірки, піпетки.

Хід роботи. Всі пробірки, піпетки, кювети повинні бути сухими. У дві пробірки наливають 2 мл реактиву №1 (обережно) і додають: в першу пробірку - 0,1 мл стандартного розчину, в другу – 0,1 мл сироватки крові. Вміст пробірок перемішують шляхом струшування і ставлять у темне місце на 20 хв. Забарвлену в зелений колір рідину колориметрують на ФЕК за червоного світлофільтра (довжина хвилі 650-660 нм), у кюветах завтовшки 5 мм проти води.

Розрахунок проводять за формулою:

ЕД ? Сст

Х =


Ест

де Х – вміст холестерину в досліджуваній сироватці , г/л; ЕД – оптична густина (екстинкція) досліджуваної крові; Ест – оптична густина (екстинкція) стандартного розчину; Сст – концентрація холестерину в стандартному розчині.

Коефіцієнт перерахунку в одиниці системи СІ (ммоль/л) дорівнює 0,0258.

Після проведення досліду зробити висновок. Пояснити отриманий результат. Для успішного проведення досліду хімічний посуд повинен бути обезжирений і абсолютно сухий. Звернути увагу на техніку безпеки при роботі з концентрованими хімічними сполуками.



ІІ. Визначення концентрації загального холестерину у сироватці крові ензиматичним колориметричним методом при допомозі напівавтоматичного біохімічного аналізатора State Fax 1904 plus.

Принцип методу.

Ефіри холестерину + Н2О – холестеролестераза холестерин + жирні кислоти;

Холестерин + О2 – холестеролоксидаза холест-4-ен-3-ен-он + Н2О2;

2О2 + 4-ААР + фенол – пероксидаза квініноміновий барвник + 4Н2О.



Матеріальне забезпечення: Свіжа сироватка крові, реагент №1 (буфер), реагент№2 (ліофілізат), реагент №3 (калібратор 5,17 ммоль/л).

Хід роботи. Підготовка реагентів до аналізу: Робочий реагент: вміст флакону №2 при акуратному перемішуванні розчинити у вмісті флакону №1.

Процедура аналізу:




Дослідна проба, мл

Калабрувальна проба, мл

Контрольна проба, мл

Сирорватка крові

0,02





Калібратор



0,02



Вода дистильована





0,02

Робочий реагент

2,0

2,0

2,0

Усі пробірки перемішати та інкубувати 15 хв при температурі 20-25С чи 10 хв при 37С. Виміряти оптичну густину дослідної і калібрувальної проб проти контрольної проби у кюветі з товщиною поглинаючого шару 10 мм при довжині хвилі 500 нм.

Розрахунок вмісту холестерину у досліджуваному зразку:

С (мг/100 мл) = 200 Едослкалібр ;

С (ммоль/л) = 5,17 Едослкалібр . Едослкалібр ;

Зробити висновок. Пояснити отриманий результат. Звернути увагу на те, що гемоліз сироватки крові є недопустимим при дослідженні. Після використання реагентів їх необхідно щільно закривати.

ЗНАЧЕННЯ ДЛЯ ФАРМАЦІЇ ТА КЛІНІКИ

У нормі в крові людини міститься 3–7 ммоль/л загального холестерину. Згідно з сучасними дослідженнями, встановлено зміни вмісту холестерину в залежності від віку. Верхня межа вмісту холестерину в плазмі крові практично здорових людей у віці 20–29 років – 5,17 ммоль/л. Високий рівень розвитку коронарного атеросклерозу у людей у віці 30–39 років і понад 40 років спостерігають за рівнів холестерину, що перевищують, відповідно, 6,21 та 6,72 ммоль/л.

Гіперхолестеринемія зустрічається при механічній жовтяниці, нефриті, нефрозі, сифілісі, гіпотиреозі, авітамінозах. Зменшення концентрації холестерину спостерігають при туберкульозі, тифі, паренхіматозній жовтяниці, гіпертиреозі, анеміях, голодуванні.

Для профілактики та лікування атеросклерозу використовують дієтотерапію (обмеження холестерину, жирів з насиченими жирними кислотами, калорійності раціону, підвищене споживання поліненасичених жирних кислот, рослинної клітковини, пектинів), ліки різних механізмів дії (інгібітори синтезу холестерину, стимулятори синтезу жовчних кислот, препарати, які стимулюють синтез ЛПВЩ, підвищують активність ліпопротеїнліпази, зв’язують у кишечнику жовчні кислоти і обмежують їх всмоктування, препарати поліненасичених жирних кислот із морських продуктів), а також різні види плазмообміну, сорбції атерогенних ліпопротеїнів на спеціальних полімерах.



Питання для контролю виконання лабораторної роботи

  1. На чому базується принцип методу визначення холестерину?

  2. Які можливі похибки при проведенні та аналізі результатів визначення холестерину?

Приклади тестів

1. У хворого з цукровим діабетом встановлено підвищення вмісту пре-β-ліпопротеїнів і триацилгліцеридів. Кількість холестерину і α-ліпопротеїнів в межах норми. До якого типу порушення обміну ліпідів можуть бути віднесені такі зміни досліджуваних показників ?

А. Гіперліпопротеїнемія ІІ типу

В. Гіперліпопротеїнемія V типу


С. Гіперліпопротеїнемія ІІІ типу

D. Гіперліпопротеїнемія ІV типу

Е. Гіперліпопротеїнемія ІІ б типу
2. Під час копрологічного дослідження встановлено, що кал знебарвлений, у ньому зафіксовано краплі нейтрального жиру. Найбільш імовірною причиною цього є порушення:

А. Надходження жовчі в кишку

B. Секреції шлункового соку

C. Кислотності шлункового соку

D. Процесів всмоктування в кишках

E. Секреції підшлункового соку

3. Найбільш інформативними біохімічними тестами при атеросклерозі є визначення в крові вмісту:

А. Холестерину

B. ЛПНЩ

C. Глюкози

D. Вільних жирних кислот

E. Кетонових тіл

4.

№ п/п

Тести

Варіанти відповідей

1

2

3



4


Оцінити зміни метаболічних показників при певних патологіях (підвищення, зниження)

Атеросклероз

Цукровий діабет

Ожиріння


Голодування

А. Кетонові тіла в крові

B. Кетонові тіла в сечі

C. Глюкоза в крові

D. Неетерифіковані жирні кисло-ти

E. Холестерин

F. -ліпопротеїни

G. Тригліцериди

H. Фосфоліпіди



I. -ліпопротеїни

Ситуаційні задачі


  1. Хворий після вживання жирної їжі відчуває нудоту, млявість, а з часом з’являються ознаки стеатореї. На що це вказує? Про нестачу яких факторів травлення жирів це свідчить і яка їх функція при цьому?

  2. При аналізі сироватки крові людини визначено загального холестерину 5 ммоль/л, фосфоліпідів 3,2 ммоль/л, тригліцеридів 1,5 ммоль/л. Чому дорівнює вміст загальних ліпідів і чи відповідає це нормі? Як називається такий стан і коли він буває?

  3. Як змінюється активність ферментів антиоксидантної системи у детоксикації кисневих радикалів та утилізації перекисів ліпідів при атеросклерозі?

Індивідуальна самостійна робота студентів

Теми для реферативних доповідей:

  1. Модифіковані форми ліпопротеїнів. Їх роль в механізмах розвитку атеросклерозу.

  2. Роль пероксидного окиснення ліпідів в етіології патогенезу атеросклерозу.

  3. Діагностика та корекція фармпрепаратами порушень процесів окиснення триацилгліцеридів.

Література

  1. Біохімічні показники в нормі і при патології / За ред. О.Я. Склярова – К.: Медицина, 2007. – С. 106-111.

  2. Строев Е.А., Макарова В.Г., Песков Д.Д. и др. Патобиохимия. – М.: ГОУ ВУНМЦ, 2002. – 234 с.

  3. Зайчик А.Ш., Чурилов Л.П. Основы общей патологии. Часть 2. Основы патохимии. – ЭлБИ-СПб, 2000. – Ч.2. – 688 с.

  4. Цыганенко А.Я., Жуков В.И., Мясоедов В.В., Завгородний И.В. Клиническая биохимия. – М.: Триада-Х, 2002. – 498 с.

  5. Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике. В 2-х т. – Минск, 2000. – Т.2. – 463 с.

  6. Клінічна біохімія / За ред. Склярова О.Я. – Київ: Медицина, 2006. – С. 64-81.

  7. Титов В.Н. Атеросклероз – патология полиеновых жирных кислот. (Обзор литературы). // Клинич. лаб. диагностика. – 2001. – №1. – С.3-9.

  8. Минушкин О.Н., Прописнова Е.П. Холестероз желчного пузыря (обзор). // Кремлевская медицина. Клинический вестник. – 2000. – №1. – С.1-4.


Тема №5. КЛІНІКО-ДІАГНОСТИЧНЕ ВИЗНАЧЕННЯ ЕНЗИМІВ У ПЛАЗМІ КРОВІ
Мета заняття: Знати основні напрямки та положення клінічної ензимології. Вміти аналізувати результати лабораторних досліджень ізоферментних спектрів та змін ензиматичної активності досліджуваних ензимів, оцінити достовірність змін та інтерпретувати виявлені зміни та активності досліджуваних ензимів, використовувати результати аналізу в діагностиці захворювань.

Актуальність теми: Ензимодіагностика, тобто дослідження активності ензимів сироватці крові широко використовується для діагностики багатьох захворювань. Знання ролі ізоферментів як маркерів розвитку патологічних процесів є необхідним для встановлення правильного діагнозу та вибору найбільш оптимального шляху лікування певного захворювання. Ензими широко використовуються як фармпрепарати.

Конкретні завдання:

  • Пояснювати біохімічні основи виникнення ензимопатій.

  • Засвоїти ензиматичні показники, що найчастіше використовуються для діагностики в гематології, кардіології, нефрології, урології, пульмонології, онкології,гематології та ін.

  • Вміти обґрунтувати використання ензимів як лікарських засобів.

  • Засвоїти методику визначення активнасті креатинкінази та вміти пояснювати отримані результати.

  • Оволодіти методикою визначення активності лужної фосфатази та інтерпретувати отримані дані.

  • Оволодіти кількісного визначення γ-глутамілтрансферази у сироватці крові та дати клініко-біохімічну характеристику отриманих результатів.

Теоретичні питання

1.Основні напрямки клінічної ензимології: ензимопатії, ензимодіагностика, ензимотерапія, імуноензиматичний аналіз.

2. Біохімічні основи виникнення ензимопатій, їх різновиди. Основні аспекти сучасної ензимодіагностики.

3. Клітинні секреторні, індикаторні та екскреторні ферменти. Ізоензими та індикаторні ензими при діагностиці захворювань.

4. Гіпер-, гіпо-, дисферментемії. Механізми гіперферментемії.

5. Ензиматичні показники, що найчастіше використовуються для діагностики в гематології, кардіології, нефрології, урології, пульмонології, онкології,гематології та ін.

6. Вплив ксенобіотиків на ензими.

8. Роль алкогольдегідрогенази в алкоголізмі.

9. Обґрунтування використання ензимів як лікарських засобів.

Блок інформації


Клінічна ензимологія — один із найважливіших розділів клінічної біохімії, яка має свої завдання, напрямок і специфічні методи дослідження. За останні десятиріччя в цій галузі досяг­нуті значні успіхи: відкрито і виділено цілий ряд нових ензимів; вивчена їх роль у різних ланках метаболізму і в організмі в цілому; створена і визнана універсальна концепція ферментопатології, яка розглядає всі захворювання як послідовні порушення в структурі і функції ферментів.

Завдяки успіхам ензимології стало можливим розкриття патогенезу ряду захворювань на молекулярному рівні, створення ефективніших методів діагностики, профілактики і лікування. Визначено основні напрямки клінічної ензимології: 1) вивчення ензимних порушень в патогенезі різних захворювань — ензимопатологія; 2) використання ензимних методів для діагно­стики — ензимодіагностика; 3) використання ензимів в тера­пії — ензимотерапія; 4) використання ензимів в лабораторній практиці як високоспецифічних аналітичних реактивів.

Ензимопатії ділять на первинні і вторинні. До першої групи відносять спадкові захворювання обміну речовин, в патогенезі яких основну роль відіграють відсутність, нестача або аномаль­на структура якого-небудь ензиму. Це зумовлює мо­лекулярні або матричні захворювання.

Друга група — захворювання, при яких ензиматичні пору­шення виникають вторинно (набуті ензимопатії), в ході патологічного процесу. Це. Причинами тих і інших ензимопатій мо­жуть бути:

І. Відсутність, недостатність або аномальна структура ензиму:

1) відсутність, недостатність чи аномальна структура апофер­менту: а) відсутність чи патологічна структура відповідних матриць ДНК і РНК; б) порушення енергозабезпечення біо­синтезу апоферменту-дефіцит АТФ, ГТУ, УТФ, ГТФ тощо; в) регуляторне порушення біосинтезу апоферменту (поси­лення утворення чи пригнічення синтезу індукторів; г) не­достатність амінокислот (голодування, розпад тканин);

2) відсутність чи недостатність коферменту: а) недостатнє надходження в організм людини вітамінів, мікроелементів, есенціальних жирних кислот; б) порушення всмоктування вітамінів у травному каналі; в) порушення процесів фосфорилювання вітамінів у кишках; г) інші порушення, що викликають гіпо- і авітаміноз; д) клітинна деструкція різ­ного генезу.

ІІ. Посилене розщеплення або виведення ензимів.

III. Гальмування активності ензимів.

IV. Відсутність активаторів ензимів.

V. Порушення температурного і рН-оптимумів, оптимальної кон­центрації субстрату тощо.

Первинні, або спадкові, ензимопатії виникають в резуль­таті змін в генетичному коді синтезу ензимів. Припускають, що причинами ферментних дефектів можуть бути аномальна струк­тура ДНК, порушення переносу генетичного коду від ДНК до РНК, змінена структура РНК і розлади в передачі інформації від РНК до рибосом. Крім того, причиною метаболічних розладів першої групи можуть бути і генетично зумовлені порушення спів­відношення природних активаторів і інгібіторів ферментів.

Всі спадкові ензимопатії з генетичної точки зору розгля­даються як результат мутацій, які проявляються характерними змінами в активності відповідних ензимів. В одних випадках ензимна активність відсутня, в інших — знижена або (дуже рідко) підвищена. Можуть появлятися патологічні ензими, які в нормі не виявляються.



Механізм ферментних порушень при спадкових ензимопатіях такий: відсутність чи значне зниження активності ензиму ви­кликає переривання чи сповільнення ходу певної ділянки обміну речовин (метаболічний блок), що є причиною нагромадження не­використаного субстрату і його попередників, які, у випадку їх токсичності, ведуть до патологічних зрушень і можуть викликати вторинний метаболічний блок. Крім того, результатом метаболіч­ного блоку є зменшення утворення продуктів ферментативної ре­акції, які нерідко служать джерелом для синтезу біологічно ак­тивних речовин. Так, наприклад, тирозин використовується для синтезу тироїдних гормонів, катехоламінів і меланінів. При недос­татньому утворенні тирозину із фенілаланіну (фенілпіровиноградна олігофренія) знижується синтез цих важливих для організму людини сполук.

Вторинні, або набуті, ензимопатії розвиваються внаслідок пошкодження тканин різними агентами (вірусами, бактеріями, найпростішими, отрутами тощо). Схематично розвиток будь-якої із набутих ензимопатій можна подати так: етіологічний фактор викликає порушення (пригнічення чи стимуляцію) роботи однієї чи декількох систем внаслідок чого змінюються обмін­ні процеси і виникає захворювання. Так, інфекційні хвороби (вірусні, бактеріальні, паразитарні) супроводжуються тяжкими розладами функцій ферментних систем насамперед в результаті дії на них екзо- і ендотоксинів мікроорганізмів, які блокують синтез ряду важливих ферментів чи гальмують їхню активність.

Різні отрути, які потрапляють в організм в силу тих чи інших причин, гальмують дію певних ферментних систем, викликають клітинну деструкцію, посилюють ферментну дезорганізацію. Так фосфорорганічні отрути пригнічують холінестеразу, а також ряд інших ферментів; ціаніди блокують ферменти тканинного дихання тощо.

Прикладом вторинних ензимопатій є ендокринні захворю­вання. Гіпо- чи гіперфункція певної ендокринної залози пов'яза­на із зниженням чи підвищенням синтезу відповідних гормонів, а отже, з порушенням роботи ферментних систем, які ними регулю­ються. Так, при діабеті дефіцит інсуліну викликає пригнічення чи стимулювання активності цілого ряду ферментів: блокується ак­тивність ферментів, які забезпечують окислення глюкози і акти­вуються ферменти глюконеогенезу, ліполізу, метаболізму білків тощо.

Гіпо- і авітамінози, недостатність незамінимих амінокислот, есенціальних жирних кислот, макро- і мікроелементів в харчово­му раціоні викликають порушення синтезу цілого ряду ферментів, сприяючи цим самим розвитку ферментопатії.

У патогенезі деяких захворювань відбувається не тільки галь­мування ферментних систем, але і їх гіперактивація. Так, напри­клад, для гострого панкреатиту характерні гіперпродукція і гіпер­активація протеолітичних ензимів, що викликає тяжкі метабо­лічні розлади. Тому штучне блокування протеаз їх інгібіторами (трансілолом, контрікалом) забезпечує при цій патології вира­жений терапевтичний ефект. При травмах легень із легеневої тка­нини в кров'яне русло викидається значна кількість фібринокіназ, які викликають гострий фібриноліз.

Таким чином, ензимопатії включають практично всю галузь патології людини. Тому важко уявити існування захворювання при якій не було б ферментних порушень.

Ензимодіагностика — один із найважливіших розділів клі­нічної ензимопатології. Найчастіше як об'єкт для дослідження використовують сиро­ватку крові, ферментний склад якої відносно постійний і має різ­номанітне походження. В сироватці крові виділяють три групи ферментів: 1) клітинні; 2) секреторні; 3) екскреторні.



Клітинні ферменти. У сироватці крові міститься ферменти, які попадають у неї з тканин в результаті фі­зіологічного старіння і відмирання клітин або підвищення про­никливості клітинних мембран. Оскільки кров'яне русло є своє­рідним колектором, який збирає метаболіти практично від всіх органів і тканин, склад клітинних ферментів в сироватці крові надзвичайно різноманітний. Рівень вмісту окремих клітинних ферментів залежить від кон­центрації їх в тканинах, молекулярної маси, топографії в клітині, періоду напівжиття ферменту і інших факторів.

У залежності від локалізації в тканинах ензими ділять на дві групи — неспецифічні і органоспецифічні. Ферменти першої групи, які каталізують універсальні реакції обміну, локалізуються в більшості органів і тканин, другої групи — в одному чи неве­ликій кількості органів. Органоспецифічні ферменти називають індикаторними, або маркерними (наприклад, креатинфосфокіназа, [КФ 2.7.3.2], в м'язовій тканині, аргіназа, [КФ 3.5.3.1] в парен­хімі печінки).



Секреторні ферменти іноді називають «власне ферментами», бо вони виконують специфічні функції в кров'яному руслі. На­приклад, ферменти згортання крові і фібринолізу синтезуються в печінці, потім надходять в кров і беруть участь в коагуляції, церулоплазмін, [КФ 1.16.3.1] забезпечує транспорт міді, ліпопротеїдліпаза, [КФ 3.1.1.34] здійснює гідроліз ліпідів тощо.

Екскреторні ферменти утворюються деякими травними зало­зами (підшлунковою залозою, слизовою кишок, ендотелієм жовчо­вивідних шляхів). Поява цих ферментів в сироватці крові пояс­нюється природним руйнуванням клітинних структур, в яких вони утворюються (лужна фосфатаза, [КФ 3.1.3.1], 5-нуклеотидаза,

ІКФ 3.1.3.5], гама-глутамілтранспептидаза, [КФ 2.3.2.2], амілаза, КФ 3.2.1.1], ліпаза, [КФ 3.1.1.3], трипсин, [КФ 3.4.21.4], енте-рокіназа, [КФ 3.4.21.9], хімотрипсин, [КФ 3.4.21.1]).



Типи змін активності ферментів при патології. Використання ферментів сироватки крові в діагностиці різних захворювань ба­зується на виявленні відхилень їх активності від нормального рівня. Відомо три типи змін активності ферментів при патології:

гіперферментемія — підвищення, гіпоферментемія — зниження активності ферментів у порівнянні з нормальною активністю; дисферментемія — поява в крові ферментів, відсутніх в нормі.

Переважна більшість ферментів змінюється при патології по типу гіперферментемії. Механізм підвищення активності фермен­тів в сироватці крові при різних видах патології ще до кінця не вивчений. Припускають, що гіперферментемія є наслідком виходу ферментів із пошкоджених органів і тканин, а при відсутності пошкоджень — результатом вегетативної перебудови організму, викликаної дією різних сильних подразників. При цьому виникає загальна реакція організму, що супроводжується порушенням ме­таболічних процесів, підвищенням проникливості клітинних мем­бран. Крім того, в механізмі гіперферментемії відіграє роль і по­силення синтезу ферментів. Можливо, вихід ферментів із уражених органів і зниження їх вмісту в тканинах індукує синтез ферментів по типу зворотнього зв'язку.

Ступінь і тривалість гіперферментемії залежить від ряду фак­торів: молекулярної маси ферменту, топографії його в клітині, концентрації в тканинах, міри і характеру пошкодження органу, маси ураженого органу, швидкості інактивації і виведення фер­менту.



Гіпоезинемія характерна для деяких ферментів, наприклад холінестерази, [КФ 3.1.1.8]. Механізм виникнення гіпоферментемії, очевидно, більш однозначний — це зниження синтезу ферменту в тканинах.

Дисферментемія характеризується тими ж механізмами роз­витку, що і гіперферментемія. Умовне виділення цієї групи сто­сується тих ферментів, які в нормі в сироватці крові не виявля­ються. По типу дисферментемії змінюються деякі органоспецифічні ферменти — сорбітолдегідрогеназа, [КФ 1.1.1.14], фруктозомоно-фосфатальдолаза, [КФ 4.1.2.13], глюкозо-6-фосфатаза, [КФ 3.1.3.9].

Ферменти використовуються в клініці в широкому діапазоні для вирішення різних завдань: 1) встановлення раннього діагнозу; 2) постановки диференційного діагнозу; 3) оцінки динаміки пе­ребігу хвороби; 4) визначення ефективності застосованого ліку­вання; 5) оцінки ступеню виздоровлення; 6) з прогностичною метою.

Для ранньої діагностики ряду захворювань використання фер­ментів виявилось більш інформативним, ніж застосування інших біохімічних тестів. Так, зміна активності аланінамінотрансферази [КФ 2.6.1.2], аспартатамінотрансферази, [КФ 2.6.1.1], альдолази, [КФ 4.1.2.13] при інфекційному гепатиті виявляється у більшості хворих значно раніше, ніж інші біохімічні показники (тімолова проба, вміст білірубіну, білкових фракцій тощо). Підвищення активності лужної фосфатази, [КФ 3.1.5.1] при рахіті, креатин-фосфокінази, [КФ 2.7.3.2], аспартатамінотрансферази, [КФ 2.6.1.1] — при інфаркті міокарду успішно використовується для ранньої діагностики цих захворювань. Особливо важлива рання діагностика при інфекційних захворюваннях. Своєчасне виявлення і ізоляція інфекційних хворих попереджує інфекцію, сприяє швид­кому призначенню адекватної терапії.

Ізоферментні спектри широко використовуються при різних ви­дах патології, насамперед в гепатології, кардіології, при захво­рюваннях нирок, підшлункової залози, легень, скелетних м'язів, в онкології, гематології тощо. Методи прижиттєвої пункційної біоп­сії дають можливість досліджувати ізоферменти в тканинах лю­дини, що достовірніше відображає картину ферментних зрушень в ураженому органі.



Гепатологія. Неспецифічні ферменти: аланінамінотрансфераза (АлАТ), аспартатамінотрансфераза (АсАТ), альдолаза, глюкозо-фосфатізомераза [ГФІ, КФ 5.3.1.9], лактатдегідрогеназа [ЛДГ, КФ 1.1.1.27], малатдегідрогеназа [МДГ, КФ 1.1.1.37], холінестераза (ХЕ), лужна фосфатаза (ЛФ), гексокіназа [КФ 2.7.1.1], альфа-кетоглутаратдегідрогеназа, [КФ 1.2.4.2], сукцинатдегідрогеназа, [КФ 1.3.99.1], альфа-гліцерофосфатдегідрогеназа, [КФ 1.1.1.8] тощо.

Органоспецифічні ферменти: сорбітолдегідрогеназа [СДГ, КФ 1.1.1.14], аргіназа, [КФ 3.5.3.1], орнітинкарбамоїлтрансфераза [ОКТ, КФ 2.1.3.3], фруктозомонофосфатальдолаза, [КФ 4.1.2.ІЗ], гуаніндезаміназа, [КФ 3.5.4.3], аденозиндезаміназа, [КФ 3.5.4.4].

Відносно специфічні: ізоцитратдегідрогеназа [ІзоЦДГ, КФ 1.1,1.41], алкогольдегідрогеназа [АДГ, КФ 1.1.1.1], глутаматдегід-рогеназа [ГДГ, КФ 1.4.1.3], транскетолаза [КФ 2.2.1.1], гістидаза [КФ 4.3.1.3], глутамінсинтетаза [КФ 6.3.1.2], бета-глюкуронідаза [КФ 3.2.1.31], гама-глутамілтранспептидаза [ГГТП, КФ 2.3.2.2], лейцинамінопептидаза [КФ 3.4.11.1], 5-нуклеотидаза [КФ 3.1.3.5], тирозиназа [КФ 1.14.18.1] тощо.

Для ранньої діагностики гострого гепатиту можна обмежитись тільки визначенням активності АлАТ, інші ж вище названі неспецифічні ферменти мають менше діагностичне значення, а тому паралельне їх визначення не раціональне.



Кардіологія. Ферменти сироватки крові: АсАТ, АлАТ, ЛДГ, МДГ, ІзоЦДГ, глюкозофосфатізомераза, альфа-кетоглутаратде-гідрогеназа, гексокіназа, альдолаза, транскетолаза і їх ізоферментні спектри.

Зміна активності названих ферментів при інфаркті міокарду має свою специфіку, яка виражається у часі появи початкових і максимальних рівнів гіперферментемії, у ступені найбільшого під­йому, в тривалості підвищення тощо. Швидше від усіх ферментів підвищується активність креатинфосфокінази і ЛДГ. Довше за інших залишається підвищеною активність ЛДГ, МДГ і ЛДГ. Чутливими критеріями глибини структурних пошкоджень вияви­лись ізоферменти АсАТ, МДГ (мітохондріальні фракції), ЛДГ, і креатинфосфокінази. Найбільш інформативним тестом, який харак­теризується великою чутливістю і специфічністю, є ЛДГ, який з успіхом використовується для диференційної діагностики органіч­них і функціональних порушень серцевого м'язу. Підвищення активності ЛДГ не спостерігається при стенокардії, тахіаритмії, перикардитах, зондуванні серця тощо. Для розмежування інфаркту і інсульту, а також ураження скелетних м'язів визначають ізоферменти креатинфосфокінази, ЛДГ і аль­долази.



Нефрологія і урологія. Сироваточні ферменти: урокіназа [КФ 13.4.99.26], арилсульфатаза [КФ 3.1.6.1], АлАТ, АсАТ, альдолаза, ЛДГ, МДГ, лейцинамінопептидаза, ГГТП, глутамінсинтетаза, глутаміназа [КФ 3.5.1.2], бета-глюкуронідаза, лужна фосфатаза, креатинфосфотрансфераза. Ізоферменти: ЛДГ, АсАТ, лейцинамінопептидази, креатинфосфокінази, альдолази. Ферменти сечі: лізоцим [КФ 3.2.1.17], урокіназа, бета-глюкуронідаза, лейцинамінопепти­даза, ГГТП, АлАТ, АсАТ, ЛДГ, альдолаза, гліцинамінотрансфераза [КФ 2.1.4.1].

Серед названих ферментів найбільш важливими є сироваткова гліцинамідінотрансфераза, ферменти сечі — лейцинамінопептидаза, ГГТП, бета-глюкуронідаза, арилсульфатаза. Певну діагностичну цінність мають ізоферменти ЛДГ, лужної фосфатази, креатин-фосфокінази в сироватці крові для виявлення ступеню ураження нирок, оцінки лікування і в деяких випадках — прогнозу захворювання.



Онкологія. Ферменти сироватки крові: гексокіназа, глюкозо-фосфатізомераза [КФ 5.3.1.9], тріозофосфатізомераза [КФ 5.3.1.1],ЛДГ, МДГ, ІзоЦДГ, альдолаза, лужна фосфатаза, креатинфосфо-кіназа, піруваткіназа [КФ 2.7.1.40], 5-нуклеотидаза, ГГТП, лей-цинамінопептидаза, бета-глюкуронідаза, АсАТ, АлАТ. Ізофермен­ти: ЛДГ, МДГ, альдолази, лужної фосфатази, піруваткінази, лей-цинамінопептидази.

Загальною закономірністю для пухлинного процесу будь-якої локалізації є підвищення активності ферментів катаболізму вуг­леводів і анаболізму білків і нуклеїнових кислот. Так, більшість злоякісних новоутворень супроводжуються підвищенням активності ряду ферментів вуглеводного обміну — гексокінази, ЛДГ, МДГ, глюкозофосфатізомерази, триозофосфатізомерази, піруваткінази.Однак ці ферменти, як неспецифічні, не можуть дати досто­вірної інформації про локалізацію пухлини, а звідси — мають обмежене значення. Дещо більш інформативними тестами в плані встановлення органного походження пухлини є лужна фосфатаза, 5-нуклеотидаза, ГГТП, лейцинамінопептидаза, креатинфосфокіна-за, ізоферменти ЛДГ і МДГ. Ізоферменти ЛДГ використовуються для діагностики раку молочної залози, пухлин матки, передміху­рової залози, мозку, шлунку, легень, нирок тощо. Ізоферментна діагностика може виявитися досить корисною для розмежування доброякісних і злоякісних пухлин.



Гематологія. Ферменти сироватки крові: гексокіназа, ЛДГ, МДГ, ІзоЦДГ, глюкозофосфатізомераза, триозофосфатізомераза, глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа, піруваткіназа, гліцеролфосфатде-гідрогеназа, альдолаза, глутаміонредуктаза [КФ 1.6.4.2], АсАТ, АлАТ.

Ізоферменти: ЛДГ, глюкозо-6-фосфатдегідрогенази, піруваткі­нази, гексокінази, креатинфосфокінази.

Ферменти в еритроцитах: глюкозофосфатізомераза, триозофос­фатізомераза, холінестераза, креатинфосфокіназа, глюкозо-6-фос­фатдегідрогеназа.

Ферменти в лейкоцитах: глутаматдегідрогеназа, ЛДГ, лужна фосфатаза, альдолаза, лізоцим, МДГ.


ПРАКТИЧНА РОБОТА


Дослід №1. Кількісне визначення γ-глутамілтрансферази у сироватці крові.

Принцип методу: L-γ-глутаміл-3-карбокси-4-нітроанілін з гліцилгліцином при дії γ-глутамілтрансферази утворюють L-γ-глутамілгліцилгліцин і 5-аміно-2-нітробензоат. Кількість утвореного 5-аміно-2-нітробензоату пропорційне активності ферменту.

Матеріальне забезпечення: Реагент № 1. Буфер (40мл). Реагент №2 L-γ-глутаміл-3-карбокси-4-нітроанілін (10).

Хід роботи: змішують необхідну кількість реагенту № 1 і № 2 у співвідношенні 4:1, тобто 4 мл і 1 мл (робочий реагент). Співвідношення робочий реагент досліджувана проба – 10:1. До 5 мл робочого реагенту додають 0,5 мл сироватки крові перемішують і через 1 хв визначають оптичну густину при при 405 нм.

Зробити висновок. Активність ГГТФ у сироватці становить 40 МО/л, що може спостерігатись при механічній жовтяниці, гострому панкреатиті, алкоголізмі, шизофренії Величини ГГТФ в нормі у сироватці крові чоловіків 6-28 МО/л, жінок – 4-18 МО/л


Дослід №2. Визначення активності лужної фосфатази.

Принцип методу: Вимірювання поглинання при 405 нм при утворенні п-нітрофенолу з паранітрофенілфосфату.

Матеріальне забезпечення: Реагент № 1. ДЕА-буфер (2х100 мл). Реагент № 2. п-Нітрофенілфосфат (40 мл)

Хід роботи: змішують реагент № 1 і реагент № 2 у співвідношенні 5:1 . Відбирають 2,4 мл робочого реагенту і 0,04мл сироватки крові. Перемішують, через 30 с визначають оптичну густину при 405 нм.

Зробити висновок. Активність лужної фосфатази становить ..., що перевищує норму. Підвищення активності ферменту спостерігається при кісткових захворюваннях, зв’язаних з проліферацією остеобластів, і захворюваннях, які супроводжуються явищами холестазу.


Дослід №3. Визначення активності креатинкінази.

Принцип методу: Креатинкіназа каталізує перетворення креатиніну у креатинфосфат. Іон фосфату, який утворюється в результаті гідролізу креатинфосфату, визначають після депротеїнування як жовтий комплекс фосфорнованадієвомолібденової кислоти.

Матеріальне забезпечення: Стандартний розчин фосфору 1,2 ммоль/л (5 мл); Амоній ванадієвокислий розчин 2 ммоль/л у хлорній кислоті 0,5 моль/л (55 мл); Амоній молібденовокислий розчин 30 ммоль/л (55 мл); Кислота трихлороцтова розчин 1,53 моль/л (35 мл); Буфер гліцин 2,5 ммоль, натрій вуглекислий 2 ммоль, магній сірчанокислий 0,17 ммоль/1 доза (1 доза) 4; Субстрат гліцин 2,5 ммоль, натрій вуглекислий 2 ммоль, магній сірчанокислий 0,17 ммоль, креатин 1,9 ммоль/1 доза (1 доза); АТФ 0,07 м моль двонатрієвої солі аденозинтрифосфату (5 доз); Активатор 0,25 ммоль цистеїн хлорида/1 (2 дози).
Склад інкубаційної суміші

Буфер гліцин /натрій вуглекислий, рН 9,8 106 ммоль/л

Креатин 45

Цистеїн хлористий 12

АТФ 4

Співвідношення сироватка/інкубаційна суміш 1/17



Виготовлення робочих розчинів.

Розчин 1 Вміст пробірки з Реактивом 6 розчиняють в 10 мл дистильованої води при 80 С, після охолодження добавляють 15 мл дистильованої води і перемішують

Розчин 2 Готують розчиненням вмісту пробірки з Реактивом 5 таким же чином, як розчин 1.

Розчин 3 Вміст пробірки з Реактивом 8 розчиняють в 5 мл дистильованої води

Розчин 4 Вміст пробірки з Реактивом 7 розчиняють в 2,1 мл дистильованої води

Розчин 5 Готують змішуванням однакових часток Реактива 2 і Реактива 3.



Хід роботи: Виконання досліду проводять згідно таблиці.

Відміряти (мл)

Проба

Контроль

розчин 1


Стандарт

Контроль

розчин 2


Розчин 1

Розчин 2


Реактив 1

Розчин 3


Сир. крові

Дист вода



0,50

-

-



0,20

0,25


-

-

0,50


-

-

0,05



0,20

0,50

-

0,50



-

-

0,20



-

0,50


-

-

-



0,25

Перемішують і попередньо інкубують 5 хв при 37 С

Тоді відмірюють

Розчин 4

0,1

0,1

0,1

0,1

Перемішують і інкубують 60 хв при 37 С

Тоді відмірюють

Розчин 4

0,30

0,30

0,30

0,30

Перемішують і центрифугують 5 хв при 3000 об/хв.



Надосадова рідина

Розчин 5


0,60

0,60


0,60

0,60


0,60

0,60


0,60

0,60


Перемішують і через 5 хв визначають оптичну густину при довжині хвилі 390-410 нм, кювета 1 см проби А1, контрольного розчину 1 (А2), стандарту (А3) і контрольного розчину (А4) проти води.
Креатинкіназа (мккат/л) = 0,33 (А12 / А34).

При різниці оптичної густини А12 вище 0,4 дослідження повторюють, зменшивши час інкубації до 10-30 хв.

Зробити висновок.

ЗНАЧЕННЯ ДЛЯ ФАРМАЦІЇ ТА КЛІНІКИ
Величини ГГТФ в нормі у сироватці крові чоловіків 6-28 МО/л, жінок – 4-18 МО/л

Збільшення активності γ-глутамілтрансферази у сироватці крові спостерігається при епідемічному гепатиті, механічній жовтяниці, гострому панкреатиті, алкоголізмі, шизофренії.

Зниження спостерігається при вагітності.

Підвищення активності ферментів викликають лікарські препарати, які здатні індукувати мікросомальну окислювальну здатність (фенобарбітал, етанол). Активність ГГТП збільшується у пацієнтів, які приймають антикоагулянти гідроксикумаринового ряду. Виражене зростання ГГТП відмічене при терапії амідопірином.

У нормі активність лужної фосфатази становить становить 0,5-1,3 ммоль/(год · л). Підвищення активності ферменту спостерігається при кісткових захворюваннях, зв’язаних з проліферацією остеобластів, і захворюваннях, які супроводжуються явищами холестазу. Активність фосфатази зростає при вірусному гепатиті, туберкульозі, амілоїдозі, механічній жовтяниці. Активність ЛФ зменшується при гіпотиреозі, цинзі, кретинізмі, мієлоїдній лейкемії.

Підвищення активності креатинкінази спостерігається при інфаркті міокарду, м’язевій дистрофії, міокардиті, генералізованих судомах, внутрішньом’язевих ін’єкціях (наркотичних і анальгізуючих препаратів), алкогольній інтоксикації, гіпотиреозі. До підвищення приводить прийом клофібрату, преднізолону, отруєння барбітуратами, а також сама процедура внутрішньом’язевого введення ліків. Зниження активності спостерігається при дії на пробу сироватки крові прямих сонячних або ультрафіолетових променів.


Контроль виконання лабораторної роботи

1.У чому полягає принцип методу визначення γ-глутамілтрансферази в сироватці крові?

2.Яке діагностичне значення має визначення γ-глутамілтрансферази в сироватці крові?

1   ...   6   7   8   9   10   11   12   13   14


База даних захищена авторським правом ©lecture.in.ua 2016
звернутися до адміністрації

    Головна сторінка