З клінічної біохімії (для студентів фармацевтичного факультету 4 курсу спеціальності «Клінічна фармація»)



Сторінка8/14
Дата конвертації05.11.2016
Розмір2.51 Mb.
1   ...   4   5   6   7   8   9   10   11   ...   14

2.Біохімічні основи порушення всмоктування і перетворення вуглеводів: (галактоземія, непереносимість фруктози, доброякісна есенціальна фруктозурія, есенціальна пентозурія).


3.Клініко-біохімічна характеристика глікогенозів і аглікогенозів.

4.Цукровий діабет та порушення толерантності до глюкози. Види цукрового діабету.

5.Лабораторні тести під час діагностики та моніторингу цукрового діабету: (глюкозотолерантний тест, цукрове навантаження, види і характеристика цукрових кривих, добовий профіль глюкози, глікозильований гемоглобін, фруктозамін, визначення глюкози в сечі, визначення кетонових тіл в сечі і плазмі крові, ліпіди при цукровому діабеті, визначення інсуліну в плазмі крові, визначення С-пептиду).

6.Клінічна картина цукрового діабету.

7.Метаболічні ускладнення при цукровому діабеті:


  • Діабетичний кетоацидоз (механізм виникнення та лабораторна діагностика);

  • Некетонова гіперосмолярна кома;

  • Лактоацидоз;

8. Гіпоглікемія, можливі причини виникнення, характеристика.

9. Віддалені ускладнення цукрового діабету:



  • мікроангіопатіїхвороби малих судин (ретинопатії та нефропатії);

  • макроангіопатіїхвороби великих судин (ішемічна хвороба серця та захворювання периферичних судин).

10.Принципи лікування цукрового діабету.

11.Патологія обміну складних вуглеводів. Патохімія захворювань сполучної тканини. Мукополісахаридоз (хвороба Гурлер, хвороба Санфіліпо, хвороба Моркіо, хвороба Гюнтера, хвороба Слая).



Блок інформації

Обмін вуглеводів в організмі регулюється нервовою системою та гормонами. Порушення вуглеводного обміну можуть бути спричинені дефіцитом специфічних ферментів обміну окремих цукрів, спадковими порушеннями. Клінічні прояви при цьому коливаються від доброякісної пентозурії у практично здорової людини до галактоземії, яка проявляється виснаженням, недостатністю печінки або важкою діареєю і дегідратацією при синдромі порушеного всмоктування глюкози і галактози. Синдром порушеного всмоктування вуглеводів є наслідком дефіциту специфічної дисахаридази щіткоподібного епітелію або недостатності системи транспорту моносахаридів. В обох випадках вуглеводи накопичуються у просвіті кишок, підвищують осмолярність шлункового соку, що створює умови для переходу води у просвіт. Діти страждають від болю і здуття живота, проносу, спостерігається затримка росту і розвитку.

Серед інших спадкових дефектів вуглеводного обміну слід назвати галактоземію – рецесивне спадкове захворювання, яке виявляється в нездатності до обміну галактози, що входить до складу лактози молока. Біохімічним дефектом при цьому є секреція в печінці і еритроцитах галактозо-1-фосфат-уридилтрансферази з порушеною активністю. Галактоземія супроводжується галактозурією. При цьому галактоза накопичується у крові, селезінці, печінці, кришталику, розвивається катаракта, цироз печінки. У дітей спостерігається затримка росту, схуднення, розумова відсталість. Вилучення галактози з їжі зберігає дитині життя.

Існують спадкові ензимопатії, пов’язані з генетичними дефектами синтезу ферментів метаболізму фруктози:

Непереносимість фруктози – аутосомна – рецесивна форма патології. Причиною її є відсутність альдолази фруктозо-1-фосфату. Наслідком відсутності цього ферменту є нагромадження фруктозо-1-фосфату у тканинах, який є інгібітором деяких ферментів вуглеводного обміну, зокрема фосфорилази глікогену. Тому при фруктоземії відбувається гальмування розпаду глікогену на етапі глюкозо-1-фосфату і наступний розвиток гіпоглікемії, посилення мобілізації ліпідів, формування стеатозу печінки і гіперурикемії. Можливі гепатоспленомегалія і цироз печінки після споживання дієти, що містить фруктозу. Дану хворобу необхідно відрізняти від доброякісної есенціальної фруктозурії, яка характеризується підвищеним вмістом фруктози в крові і сечі, що може призвести до постановки хибного діагнозу – цукрового діабету. Ця форма патології важливого клінічного значення не має. Вона виникає внаслідок відсутності в нирках, печінці і ентероцитах фруктокінази. В результаті фруктоза не перетворюється у фруктозо-1-фосфат і у вільному вигляді виділяється із сечею.

Есенціальна пентозурія – аутосомно-рецесивний дефект ферменту L-ксилулозо-редуктази. Хворі виділяють до 4 г ксилулози за добу із сечею, що також може призвести до постановки неправильного діагнозу цукрового діабету. Однак, ксилулоза – це пентоза, яка не дає реакції з глюкозооксидазою, що використовується для диференціювання з глюкозурією. Пентозурія не викликає суттєвих клінічних проявів.

Спадково знижена активність будь-якого з ферментів розпаду або синтезу глікогену призводить до розвитку глікогенозу, який належить до хвороб накопичення. Найпоширенішим глікогенозом є хвороба Гірке, що виникає внаслідок дефіциту глюкозо-6-фосфатази. У дітей захворювання проявляється надмірним відкладанням глікогену в печінці і нирках, гіпоглікемією. Спостерігається затримка фізичного і психічного розвитку. При хворобі Герса виявляється низька активність фосфорилази І, відкладання глікогену в печінці і лейкоцитах. Дифузний глікогеноз (хвороба Фобса) характеризується появою глікогену з короткими численними зовнішніми гілками. Це захворювання пов’язують з пониженою активністю аміло-1,6-глюкозидази. У дітей, що хворіють на цю форму глікогенозу, спостерігаються набряки, кровоточивість. Глікоген депонується в печінці, м’язах, еритроцитах, лейкоцитах.



Мукополісахаридоз – це група захворювань, для яких характерне відкладання в різних тканинах організму полімерних вуглеводів – глікозаміногліканів (мукополісахаридів). Вони входять до складу основної міжклітинної речовини, містяться також у нейронах, аксонах і глії мозку. Захворювання зумовлене дефектом специфічної лізосомної гідролази, що бере участь у послідовному розщепленні глікозаміногліканів. Хворим властиві гротескні риси обличчя, деформація кісток скелету (множинний дизостоз), суглобів. Уражається печінка, селезінка, серце, кровоносні судини. При деяких видах мукополісахаридозу не тільки збільшується кількість глікозаміногліканів у мозку, але й змінюється їх співвідношення з гангліозидами, що проявляється розумовою відсталістю.

Цукровий діабет - захворювання, яке розвивається при недостатньому синтезі -клітинами острівців Лангерганса підшлункової залози інсуліну. Розрізняють два основних типи цукрового діабету: тип І- інсулінозалежний діабет (ІЗЦД), тип ІІ - інсулінонезалежний діабет (ІНЦД).

Цукровий діабет І типу (ІЗЦД) є наслідком руйнування - клітин острівцевого апарату. У багатьох хворих причиною захворювання на цукровий діабет є дефект імунної системи, при цьому проходить порушення перетворення проінсуліну в інсулін.

У хворих на діабет ІІ типу (ІНЦД) -клітини виробляють достатню кількість інсуліну, з часом вони навіть гіпертрофуються, а рецептори органів - мішеней втрачають здатність реагувати на інсулін. З часом спостерігається повільне зниження секреції інсуліну.

При захворюванні на цукровий діабет, незалежно від етіологічних факторів, порушується вуглеводний, білковий, жировий та мінеральний обмін. Порушення обміну вуглеводів пов’язане з: а) транспортом глюкози у м’язову і жирову тканину; б) пригніченням окиснення глюкози при фосфорилюванні її у зв’язку зі зниженням активності ферментів гексокінази та глюкокінази; в) зниження синтезу глікогену в печінці внаслідок зниження активності глікогенсинтетази; г) посиленням глюконеогенезу.

Внаслідок порушення жирового обміну утворюються недоокислені продукти - кетонові тіла, що призводять до кетоацидозу. Порушення білкового обміну зв’язане з пригніченням синтезу білків та підвищенням їх розпаду, що призводить до розвитку диспротеїнемії.

Одним із методів біохімічної діагностики цукрового діабету є крива толерантності до глюкози (цукрова крива). Обстежуваному беруть кров з пальця для визначення в ній глюкози, потім дають випити глюкозу з розрахунку 1 г на 1 кг маси тіла в склянці з водою і через кожні 30 хв протягом 3-х годин беруть кров з пальця і визначають в ній вміст глюкози. Два типи цукрових кривих (у здорової людини та хворої на цукровий діабет) приводиться нижче у розділі “Значення для фармації та клініки”.

Дослідження впливу цукрового навантаження на вміст цукру в крові відіграє суттєву роль в діагностиці порушень глікогенутворюючої функції печінки та виявленні прихованих форм діабету.

Крім кривої толерантності до глюкози, з діагностичною метою використовують наступні тести: а) оральне вживання глюкози (100 г); б) внутрішньовенне введення глюкози (0,33 г глюкози на 1 кг маси тіла); в) визначення цукру в сеч; г) визначення кетонових тіл в крові та сечі; д) визначення білка в сечі; е) ретроспективна оцінка рівня глікемії по визначенню глікозильованого гемоглобіну А1. Підвищений рівень глюкози в позаклітинній рідині викликає приєднання її (глікозилювання) до молекул білків плазми крові, особливо до молекул гемоглобіну. Глікозилювання є незворотнім процесом. Ступінь глікозилювання гемоглобіну (глікозильований гемоглобін) залежить від кількості глюкози в крові і може використовуватись як тест для ретроспективної оцінки глікемії. є) визначення добового профілю глюкози.



Фруктозамін (глікозильовані білки плазми крові) є показником ступеня глікозилювання білків плазми крові). При цукровому діабеті, внаслідок гіперглікемії швидкість глікозилювання білків збільшується, що є причиною ускладнень діабету: пошкодження нирок, сітківки і кришталика ока (помутніння кришталика, катаракта), нервів і артерій. Пошкоджені тканини мають спільну властивість: проникнення глюкози в їх клітини не залежить від інсуліну. Відповідно в них концентрація глюкози така ж як і в крові.

Цукровий діабет діагностують при наявності, крім клінічних симптомів (поліурії, полідипсії і поліфагії), ряду специфічних порушень обмінних процесів - гіперглікемії (збільшення кількості глюкози в крові), глюкозурії (поява цукру в сечі), гіперкетонемії (збільшення кількості кетонових тіл в крові) та кетонурії (виділення кетонових тіл з сечею).

Гіпоглікемізуюча терапія включає застосування препаратів інсуліну, негормональних цукрознижуючих препартів, фітотерапії.

Інсулінотерапія абсолютно показана для лікування ІЗЦД. Введення інсуліну сприяє транспорту глюкози через клітинні мембрани і її утилізації периферичними тканинами (м’язами, жировою тканиною). Крім того, на фоні дії інсуліну підвищується каталітична дія гексокінази, яка сприяє перетворенню глюкози у глюкозо-6-фосфат. Під впливом інсуліну активується глікогеногенез (активується фермент глікогенсинтетаза). Інсулін стимулює також синтез білків і жирних кислот.

Застосування інсуліну при цукровому діабеті призводить до зниження рівня цукру в крові і нагромадженню в тканинах глікогену. Зменшення глюкози у крові усуває глюкозурію і пов’язані з нею підвищений діурез (поліурія) та спрагу (полідипсія). Наслідком нормалізації вуглеводного обміну є покращення білкового обміну (зменшується концентрація в сечі азотових сполук) і жирового обміну ( у крові та сечі перестають визначатися кетонові тіла). Припиняється похудання і надмірно виражене відчуття голоду (булімія), пов’язані з розпадом жирів та інтенсивним перетворенням білків у глюкозу.

Для проведення лікування інсуліном можуть бути використані препарати різної тривалості дії: препарати короткої дії (моноінсулін, Н-інсулін, актрапід МС та ін); препарати проміжної дії (семілонг, лонг, семіленте та ін); препарати тривалої дії (ультралонг, ультраленте, ультратард). Всі фармацевтичні препарати інсуліну, які використовуються в клінічній практиці можна розділити на гетерологічні (з підшлункових залоз крупної рогатої худоби) і гомологічні (людські, отримані шляхом бактеріального синтезу або напівсинтетичним методом). Звичайно, що перевага надається гомологічним інсулінам. Крім того, при виборі препарату інсуліну необхідно звертати увагу на ступінь очистки препарату від білкових домішок. Перевагу слід віддавати високоочищеним монокомпонентним препаратам.

Негормональні цукрознижуючі препарати включають препарати сульфонілсечовини, бігуаніди та інгібітори -глюкозооксидази.



Препарати сульфонілсечовини володіють в основному панкреатичною дією і стимулюють секрецію інсуліну -клітинами. Відбувається це наступним чином:

Похідні сульфонілсечовини


(бутамід, хлорпропамід та ін.)

Блок АТФ-залежних К+ - каналів

-клітин острівців Лангерганса

Деполяризація мембран -клітин


Відкривання потенціалзалежних Са2+-каналів -клітин

Входження Са2+ всередину -клітин


Виділення інсуліну
Крім того, ці препарати гальмують глюконеогенез, глікогеноліз, ліполіз, продукцію глюкагону, сприяють підвищенню рецепторної чутливості до інсуліну. До них відносяться толбутамід, цикламід, гліквідон, гліклазид, гліпізид та ін. Основними показами для лікування препаратами сульфонілсечовини включають ті форми ІНЦД, які не компенсуються дієтою.

Бігуаніди є похідними гуанідину. Механізм дії – екстрапанкреатичний. Бігуаніди потенціюють ефект інсуліну на рецепторному і пострецепторному рівні (активізують анаеробний гліколіз), гальмують всмоктування глюкози в кишечнику, глюконеогенез і глікогеноліз. Крім того, ці препарати володіють анорексигенним ефектом, незначною гіполіпідемічною і фібринолітичною дією. До таких препаратів відносяться: метформін, метформінретард, буформін та ін. Показами для застосування бігуанідів є ІНЦД з ожирінням.

Інгібітори глюкозооксидази впливають на інтенсивність розщеплення полісахаридів і всмоктування глюкози в кишечнику. Це нові препарати, які мають порівняно слабкий гіпоглікемічний ефект, але володіють побічною дією- розвитком мальабсорбції. Синдром мальбабсорбції вуглеводів – це “ферментний блок”, який утворюється або на етапі їх всмоктування, або на ранніх стадіях їх проміжного обміну.

В лікуванні цукрового діабету використовується фітотерапія. Цей метод є додатковим до раніше перерахованих. Випускаються офіцинальні гіпоглікемічні збори трав – арфазетин, мірфазетин та ін.



Методи визначення концентрації глюкози в крові поділяються на: редуктометричні, колориметричні, які залежно від хімічної природи аналітичної реакції поділяються на ферментативні і неферментативні.
ПРАКТИЧНА РОБОТА

Дослід 1. Визначення глікозильованого гемоглобіну за реакцією з тіобарбітуровою кислотою (Stander, Eaton, 1983 р.)

Принцип методу. Еритроцити відмивають від білків плазми і глюкози: глікозильований гемоглобін, який в них міститься, гідролізується нагріванням із щавелевою кислотою. При цьому із залишків моносахариду утворюється 5-оксиметилфурфурол, кількість якого визначають за кольоровою реакцією з тіобарбітуровою кислотою. Одночасно визначають концентрацію гемоглобіну в гемолізаті. Результати виражають відсотками глікозильованих молекул гемоглобіну.

Проводити дослід рекомендується із застосуванням біохімічного напівавтоматичного аналізатора "Stat fax".

Матеріальне забезпечення. Реактив 1: щавелева кислота, 0,5 ммоль/л (розчиняють 22,5 г H2C2O4 в 0,5 л води); реактив 2: щавелева кислота, 0,2 ммоль/л ( готують із 0,5 ммоль/л, змішуючи 40 мл реактиву 1 і 60 мл води; реактив 3: трихлороцтова кислота (ТХО), 40%-й розчин; реактив 4: натрію хлорид, 0,9%; реактив 5: тіобарбітурова кислота (ТБК), 50 ммоль/л (розчиняють 0,72 г ТБК приблизно у 80 мл води, доводять рН до 6,0, додаючи 1Н NaOH, переливають в мірну колбу і доводять об’єм водою до 100 мл; реактив 6: калібрувальний розчин 5-оксиметилфурфуролу (126 мг незабарвленого препарату розчиняють в 100 мл 0,25 моль/л розчину щавлевої кислоти – отримують розчин, який містить 10 ммоль/л. Його розводять у 100 разів тим же розчином щавелевої кислоти, отримують розчин з концентрацією 100 мкмоль/л. З нього шляхом відповідного розведення 0,25 моль/л щавелевою кислотою готують серію калібрувальних розчинів з концентраціями 12,5 – 100 мкмоль/л. Зберігають у замороженому стані при – 200 С. Замість калібрувального розчину 5-оксиметилфурфуролу можна використовувати розчини фруктози, які готують так само, лише для вихідного розчину з концентрацією 10 ммоль/л беруть 180 мг фруктози, розчиняючи в 100 мл розчину щавелевої кислоти 0,25 моль/л.

Хід роботи. Кров для дослідження беруть, використовуючи як антикоагулянт етилендіамінтетраоцтову кислоту або її солі. В 10 мл ізотонічного розчину натрію хлориду виливають 0,3-0,5 мл цільної крові, перемішують і центрифугують. Надосадову рідину відбирають, до осаду еритроцитів знову додають 10 мл ізотонічного розчину натрію хлориду, перемішують і знову центрифугують. Відмиті еритроцити можуть зберігатися до початку аналізу при – 40 С до 15 днів.

Еритроцити кількістю 0,1 мл переносять в 1,4 мл води і перемішують, гемоглобін у розчині можна вимірювати методом Салі. При цьому необхідно пам’ятати, що концентрація гемоглобіну в розчині приблизно в 7 раз менша, ніж в цільній крові, т.б. біля 20 г/л. Результати виражають в молях на 1 л.

До 1 мл гемолізату додають 0,5 мл щавелевої кислоти 0,5 моль/л і закривають пробірку щільним гумовим корком, в який вставлена тонка голка для ін’єкцій. Закриту корком пробірку ставлять на киплячу водяну баню і через 10 хвилин виймають голку, а щільно закриту пробірку продовжують нагрівати при 1000 С ще 5 годин. Після цього охолоджують у льодяній воді і додають 1 мл охолодженої на льоду ТХО. Старанно перемішують і осад відокремлюють шляхом центрифугування протягом 10 хвилин при 1000 g. До 1,5 мл надосадової рідини додають 0,5 мл розчину ТБК і с тавлять на 30 хвилин у водяну баню при 400 С. Після цього фотометрують у кюветі товщиною 10 мм при довжині хвилі 443 нм проти контролю, забарвлення зберігається стійким протягом щонайменше 2 годин.

На всю серію визначень ставлять один контрольний дослід. Для цього змішують залишки декількох гемолізатів та із верхнього шару відбирають 1 мл, в ньому проводять гідроліз і осадження білків ТХО; так як і в досліді, відбирають 1,5 мл надосадової рідини, але до неї додають замість розчину ТБК 0,5 мл води. Суміш інкубують разом з пробами 30 хвилин при 400 С.

Для побудови калібрувального графіка до 1 мл калібрувального розчину, який містить 5-оксиметилфурфурол в концентрації 12,5-100 мкмоль/л, додають 0,5 мл води і 1 мл розчину ТХО. Із проби відбирають 1,5 мл, до яких додають 0,5 мл розчину ТБК і ставлять кольорову реакцію, інкубуючи на водяній бані при 400 С протягом 30 хвилин, так як і в основному досліді. Калібрувальні проби фотометрують проти контрольної калібрувальної проби, в яку замість калібрувального розчину 5-оксиметилфурфуролу беруть 1 мл розчину щавелевої кислоти 0,25 моль/л.

Для здійснення розрахунку спочатку вираховують вміст глікозильованого гемоглобіну в 1 л еритроцитів, для цього кількість 5-оксиметилфурфуролу, розраховану за калібрувальним графіком, перемножують на 15 (розведення при отриманні гемолізату). Пізніше розраховують вміст гемоглобіну в тій же еритроцитарній масі, перемножуючи його вміст в гемолізаті на 15. Для переведення результату в ммоль/л необхідно його розділити на 64. Для вираження кількості глікозильованого гемоглобіну в молярних відсотках, його концентрацію в еритроцитарній масі в моль/л, ділять на вміст гемоглобіну в тих же одиницях і перемножують на 100. Для розрахунку можна скористатися формулою: Глі-Hb х 64

Молярні % Глі-Hb = ,

Hb х 100

де: Глі-Hb – вміст оксиметилфурфуролу в гемолізаті (ммоль/л);

Hb – вміст гемоглобіну в гемолізаті (г/л).

Примітки.

  1. В результаті гідролізу і осадження білків ТХО розчин злегка забарвлюється, тому вводять спеціальну контрольну пробу, яку можна ставити тільки одну на всю серію.

  2. Вміст 5-оксиметилфурфуролу в калібрувальному розчині може бути розрахований за формулою:

К= 813 х Е 443 – 6,18;

де Е 443 – оптична густина за довжини хвилі 443 нм.

Зробити висновок.

ЗНАЧЕННЯ ДЛЯ КЛІНІКИ ТА ФАРМАЦІЇ

Нормальні величини глікогемоглобіну відносно загального вмісту гемоглобіну становлять: 4,5 – 6,1 % . Глікозильований гемоглобін використовується як показник ефективності лікування цукрового діабету. Чим ближче до норми його концентрація, тим краще підібрана терапія. При цьому загальнопринятим вважається, що значення, отримані в межах 5,5-10% як добре компенсований цукровий діабет, 10-12% -частково компенсований діабет, > 12% - некомпенсований цукровий діабет.

Глюкоза має властивість вступати в неферментативну взаємодію з білками, а власне, з гемоглобіном з утворенням основ Шиффа. Вираженість глікозилювання гемоглобіну пропорційна концентрації глюкози у крові і тривалості контакту глюкози з гемоглобіном. Ступінь глікозилювання гемоглобіну відображає середню концентрацію глюкози за проміжок часу 4-6 тижнів до виконання аналізу (період півжиття молекули гемоглобіну). Даний показник дозволяє ретроспективно оцінити рівень гіперглікемії при цукровому діабеті. Необгрунтовано занижені результати відмічаються при станах, пов’язаних з інтенсивним відновленням молекул гемоглобіну – після кровотеч, при гемолітичних анеміях.

Дослід 2. Вплив цукрового навантаження на вміст цукру в крові.

Дослідження впливу вуглеводного навантаження на рівень цукру в крові відіграє суттєву роль в діагностиці порушень глікогенутворюючої функції печінки та виявленні прихованих форм діабету. У досліджуваного натще визначається базальний рівень глюкози. Необхідно підкреслити, що вуглеводне навантаження можна проводити тільки, коли рівень глюкози в крові натще знаходиться в межах фізіологічної норми. Пізніше пацієнт отримує перорально 75 г глюкози (із розрахунку 1 г глюкози на 1 кг маси тіла), розчиненої в 300 мл води, випитої за 5 хв. Рівень глюкози плазми крові (вимірюється глюкозооксидазним методом чи методом Хагедорна – Йєнсена, принцип яких наведений нижче) кожні 30 хв протягом 3 год. Після прийняття глюкози спостерігається збільшення концентрації цукру в крові, яке досягає свого максимуму коло 60-ї хвилини. Через 120 хвилин рівень цукру в здорової людини може бути навіть нижчий від вихідного рівня. Через 180 хвилин рівень цукру в здорової людини, як правило, нормалізується. На основі отриманих даних необхідно побудувати цукрову криву, відкладаючи на вертикальній осі кількість цукру в моль/л, а на горизонтальній – час у хвилинах.

Студенти отримують три заздалегідь приготовані проби, у яких змодельовані різні концентрації цукру в крові та проводять визначення його концентрації. На основі отриманих даних будують цукрову криву і роблять висновок: отримані дані відповідають цукровій кривій здорової людини або отримані дані характерні для цукрової кривої хворого на цукровий діабет.

Визначення концентрації глюкози в крові глюкозооксидазним методом.

Принцип методу. Окиснення глюкози киснем повітря під дією глюкозооксидази з утворенням гідрогену пероксиду, який за присутності фенолу з 4 – Аміно – Феназоном (4- Аміноантипірином) утворює забарвлену сполуку.

Матеріальне забезпечення: глюкозооксидаза (активність 60 000 – 120 000 од/г), пероксидаза з кінського хрону (активність 11 000 од/мг), фенол, 4 – аміно – феназон, - Д- глюкоза, фосфатний буфер 0,1 М рН 7,0 робочий реактив (150 мг/л глюкозооксидази, 1,1 мг/л пероксидази, 1,034 г фенолу, 0,148 г 4 – аміно – Феназону, довести фосфатним буфером до 1 л, стабільний протягом 1 міс в посудині з темного скла за температури 4 С), 0,2 % розчин бензойної кислоти (2 г бензойної кислоти розчиняють у 800 мл дистильованої води під час нагрівання, після охолодження об’єм розчину доводять у мірній колбі на 1000 мл до позначки дистильованою водою, фільтрують), основний калібрувальний розчин глюкози 27,75 ммоль/л (500 мг висушеної до постійної маси Д – Глюкози розчиняють у мірній колбі на 100 мл в невеликій кількості 0,2 % розчину бензойної кислоти), калібрувальний розчин глюкози 5,55 ммоль/л (100 мг/100мл), стандарт (основний калібрувальний розчин глюкози розводять у 5 разів 0,2 % розчином бензойної кислоти), розчин хлоридної кислоти 0,33 ммоль/л.

Хід роботи. Послідовність досліду представлено у табл.1

Таблиця 1. Послідовність визначення концентрації глюкози в крові глюкозооксидазним методом



Інградієнти

Дослідна проба, мл

Стандартна проба, мл

Контрольна проба, мл

Сироватка, плазма

0,02

-

-

Стандарт

-

0,02

-

Робочі реактиви

2

2

2

Вміст пробірок перемішують, інкубують за кімнатної температури 30 – 60 хв. Колориметрують за довжини хвилі 490 – 540 нм проти контрольної проби. Результати обчислюють за формулою:

Сдосл. = Сст. Едосл ,

Ест.

де: Сдосл. – концентрація глюкози в дослідній пробі, ммоль/л; Сст. - концентрація глюкози в стандартній пробі, ммоль/л; Едосл. – екстинкція дослідної проби; Ест. - екстинкція стандартної проби.

Порівняти з нормою отриманий результат. Зробити висновок.

Визначення можна проводити за допомогою наборів реактивів фірми “Cormay”, “La chema”, “Merck” та напівавтоматичного аналізатора “Stat Fax”.



Визначення цукру в крові за методом Хагедорна-Йенсена.

Принцип методу. Метод визначення цукру в крові грунтується на окисненні глюкози в безбілковому фільтраті з одночасним відновленням калію феррицианіду (ІІІ)- (червона кров'яна сіль) - у калію ферроціанид (ІІ)- (жовту кров'яну сіль). Залишок червоної кровяної солі, що не прореагував, визначають йодометричним методом. Йод, що виділився в кількості, еквівалентній кількості залишку червоної кров’яної солі, відтитровують розчином натрію тіосульфату, а кількість цукру в крові вираховують, виходячи з даних титрування, за допомогою таблиці 2.

Механізм вказаних реакцій може бути поданий у вигляді такої схеми:

1. К3Fe (CN)6 + цукор K4Fe (CN)6 + продукти + К3Fe (CN)6

окиснення

цукру

2. 2 K4Fe (CN)6 + 3 ZnSO4 K2Zn3Fe (СN)6 2 + 3 K2SO4



3. 2К3Fe (CN)6 + 2КІ 2 K4Fe (CN)6 + І2

4. І2 + 2 Na2S2O3 2 NaI + Na2S4O6

натрію тіосульфат натрію тетратіонат

Матеріальне забезпечення. Кров, 0,1 н розчин натрію гідроксиду, 0,45% розчин цинку сульфату, 0,005 н розчин калію ферриціаніду (ІІІ), потрійний розчин (суміш в розчині цинку сульфату, натрію хлориду та калію йодиду), 3% розчин ацетатної кислоти, 1% розчин крохмалю, 0,005Н розчин натрію тіосульфату, дистильована вода, штатив з пробірками, скляні лійки, скляні палички, мікропіпетка на 0,1 мл, фільтри, водяна баня (1000С), газовий пальник, цукрові пробірки, вата.

Хід роботи. У дві цукрові пробірки вносять по 1 мл 0,1 н розчину натрію гідроксиду і по 5 мл 0,45% розчину сульфату цинку. Утворюється колоїдний розчин цинку гідроксиду. В одну з пробірок (досліджувана проба) додають мікропіпеткою 0,1 мл крові і два-три рази промивають її колоїдним розчином, у другу пробірку (контрольну) вносять 0,1 мл дистильованої води. Обидві пробірки ставлять на 2-3 хв. у киплячу водяну баню, білок денатурується і випадає в осад. Суміш фільтрують, зливаючи її по скляних паличках у інші пробірки, в які перед тим були вставлені лійки із зволоженим гарячою водою маленьким жмутком вати. Кожну пробірку промивають двічі, набираючи по 3 мл гарячої дистильованої води, промивні води зливають по скляній паличці на ватні фільтри та дають їм добре стекти.

До прозорого фільтрату в кожну цукрову пробірку додають по 2 мл 0,005 н розчину калію ферриціаніду і ставлять пробірки на 15 хв у киплячу водяну баню. За цей час глюкоза повністю окиснюється. Пробірки охолоджують і перемішуючи, додають в кожну з них по 3 мл потрійного розчину, по 2 мл 3% розчину оцтової кислоти та по 2 краплі 1% розчину крохмалю та на білому фоні йод, що виділився відтитровують 0,005 н розчином натрію тіосульфату до повного зникнення синього забарвлення. Кількість глюкози визначають за таблицею (див.таблицю 2).



Приклад розрахунку. Припустимо, що на титрування вмісту досліджуваної проби пішло 1,43 мл 0,005 н розчину натрію тіосульфату, а на титрування вмісту контрольної – 1,97 мл. З таблиці знаходять для досліджуваної проби величину 0,101, а для контрольної проби – 0,005. Вміст глюкози в крові дорівнює 0,101 – 0,005 = 0,096 в 0,1мл або 0,096 1000=96 мг%. Переведення на міжнародну систему (СІ):

96 мг% 0,05551 = 5,33 ммоль/л. Порівняти з нормою отриманий результат. Зробити висновок.

Таблиця 2.Вміст цукру в крові за методом Хагедорна – Йєнсена

Гіпо-сульфат

Натрію


0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

0,0

0,1


0,2

0,3


0,4

0,5


0,6

0,7


0,8

0,9


1,0

1,2


1,3

1,4


1,5

1,6


1,7

1,8


1,9

0,385

0,355


0,331

0,310


0,290

0,270


0,251

0,232


0,213

0,195


0,177

0,159


0,141

0,106


0,088

0,070


0,052

0,034


0,017

0.382

0,352


0,329

0,308


0,288

0,268


0,249

0,330


0,211

0,193


0,175

0,157


0,139

0,104


0.086

0,068


0,050

0,032


0,015

0,379

0,350


0,327

0,306


0,286

0,266


0,247

0,228


0,209

0,191


0,173

0,155


0,138

0,102


0,084

0,066


0.048

0,031


0,014

0,376

0,348


0,325

0,304


0,224

0,264


0,245

0,226


0,208

0,190


0,172

0,154


0,136

0,101


0,083

0,064


0,47

0,029


0,012

0,373

0,345


0,323

0,302


0,282

0,262


0,243

0,224


0,206

0,188


0,170

0,152


0,134

0,099


0,081

0,063


0,045

0,027


0,010

0,370

0,343


0,321

0,300


0,280

0,260


0,241

0,222


0,204

0,186


0,168

0,150


0,132

0,097


0,079

0,061


0,043

0,027


0,008

0,367

0,341


0,318

0,298


0,278

0,259


0,240

0,221


0,202

0,184


0,166

0,148


0,131

0,095


0,077

0,59


0,041

0,024


0,007

0,64

0,338


0,316

0,296


0,276

0,257


0,238

0,219


0,200

0,182


0,164

0,146


0,120

0,093


0,075

0,057


0,039

0,022


0,005

0,361

0,336


0,314

0,294


0,274

0,255


0,236

0,217


0,199

0,181


0,163

0,145


0,127

0,092


0,074

0,056


0,038

0,020


0,003

0,358

0,333


0,312

0,292


0,272

0,253


0,234

0,215


0,197

0,179


0,161

0,143


0,125

0,090


0,072

0,054


0,036

0,019


0,002

Визначення цукру в крові орто - тоуїдиновим методом (за Гульманом)

Принцип методу: глюкоза при нагріванні з ортотолуїдином у розчині оцтової кислоти утворює сполуку синьо – зеленого забарвлення, інтенсивність якого є прямопропорційне до вмісту глюкози.

Матеріальне забезпечення: кров, 3% розчин трихлорацетатної кислоти (ТХАк), орто–толуїдиновий реактив, стандартний розчин глюкози (4ммоль/л 720 мг глюкози розчинити в 1л дистильованої води), дистильована вода, штатив з пробірками, піпетки, мікропіпетка на 0,1мл , центрифуга, центрифужні пробірки, ФЕК, водяна баня (100°С).

Хід роботи: у дві центрифужні пробірки наливають по 0,9мл 3% розчину ТХАк. В одну з них вносять 0,1мл крові, а в другу – 0,1мл стандартного розчину глюкози. Вміст пробірок перемішують і центрифугують при 3000 об/хв. протягом 10 хвилин. З кожної пробірки відбирають по 0,5мл надосадової рідини та додають по 4,5мл орто-толуїдинового реактиву. Поміщають пробірки в водяну баню на 8хв. Потім виймають з водяної бані та охолоджують до кімнатної температури. Після цього на ФЕКу визначають оптичну густину проб у кюветах на 10мм проти води при довжині хвилі 630 нм (червоний світлофільтр).



Розрахунок. Вміст глюкози визначають за формулою:

Сстанд. · Адосл.

Сдосл. = ---------------------------------,

Астан.


де: С - концентрація глюкози в ммоль/л

Сстанд. - концентрація стандартного розчину глюкози

Адосл. - оптична густина досліджуваної проби

Астанд. - оптична густина стандартного розчину глюкози

Порівняти з нормою отриманий результат. Зробити висновок.

ЗНАЧЕННЯ ДЛЯ КЛІНІКИ ТА ФАРМАЦІЇ

Якісне та кількісне визначення цукру в крові та сечі має важливе клініко-діагностичне значення. Фізіологічна гіперглікемія спостерігається при емоційних стресах, споживанні великої кількості вуглеводів з їжею. Патологічні гіперглікемії найчастіше пов’язані із захворюваннями ендокринної системи. Вони спостерігаються при цукровому діабеті, пухлинах кори наднирників та гіпофізу, важких розладах функції печінки, гіперфункції щитовидної залози, органічних ураженнях нервової системи. Гіпоглікемія спостерігається при аденомі острівцевого апарату підшлункової залози внаслідок підвищеної продукції інсуліну - клітинами, недостатній функції щитовидної залози, наднирників, гіпофізу. Крім того, гіпоглікемія може бути викликана голодуванням, важкою фізичною працею, передозуванням інсуліну при лікуванні, порушенням всмоктування вуглеводів, захворюванням нирок, які супроводжуються зниженням ниркового порогу для глюкози.

Особливе значення має дослідження цукрового навантаження на рівень цукру в крові. Метод цукрового навантаження дозволяє виявити приховані форми діабету, порушення глікогенутворювальної функції печінки та вплив інсуліну на обмін вуглеводів. Для орієнтації студентів нижче приводимо два типи цукрових кривих: № 1 - у здорової людини та № 2 - у хворої на цукровий діабет.

Вміст глюкози,ммоль/л

11,5

9,2


№ 2

6,9


4,6 № 1

2,3


30 60 90 120 150 180 час, хв

Суттєве клініко-діагностичне значення має діагностичний тест на кетонові тіла в крові та сечі. Наприклад, кетонурія при ІЗЦД (І типу) вказує на загрозу кетоацидозу. Відсутність кетонемії або кетонурії під час коматозних станів дозволяє виключити кетоацедотичну кому, як причину порушення. Необхідно мати на увазі, що й інші метаболічні стани: голодування, алкогольний кетоацидоз, вживання їжі багатої на жири та гарячка можуть призвести до утворення кетонових сполук та появи кетонемії, кетонурії.



Ізотонічні розчини глюкози служать джерелом рідини і харчового матеріалу, а також сприяють знешкодженню та виведенню отрут із організму. Гіпертонічні розчини підвищують осмотичний тиск крові, сприяють зневодненню тканин, посилюють обмінні процеси, антитоксичну функцію печінки, серцеву діяльність, збільшують діурез, володіють детоксикаційними властивостями. Розчини глюкози широко застосовують при гіпоглікемії, інфекційних захворюваннях, хворобах печінки, декомпенсації серцевої діяльності, набряку легень, токсикоінфекціях, різних інтоксикаціях та інших патологічних станах.

Знайшли застосування в медицині також й інші цукри. Лактулоза – синтетичний дисахарид, не всмоктується в шлунково-кишковому тракті при його пероральному введенні. Попадаючи в кишечник, лактулоза стимулює перистальтику і усуває закрепи. Крім того, розщеплюючись у товстій кишці, звільняє іони водню, зв’язує вільний аміак, збільшує дифузію аміаку з крові в кишечник і сприяє виділенню аміаку з організму. Застосовують лактулозу в суміші з галактозою і лактозою у вигляді сиропу при хронічних закрепах, а також при печінковій енцефалопатії у хворих з хронічними захворюваннями печінки.


Контроль виконання лабораторної роботи


  1. У чому полягає принцип кількісного визначення глікозильованого гемоглобіну у крові?

  2. У чому полягає принцип кількісного визначення цукру в крові глюкозооксидазним методом?

  3. У чому полягає принцип методу кількісного визначення цукру в крові за Хагедорном - Йенсеном?

  4. Який метод визначення цукру в крові є більш специфічний та технічно простий у виконанні: редуктометричний чи колориметричний?

  5. В чому полягає суть методу цукрового навантаження?


Приклади тестів

1. Найактивнішим стимулятором секреції інсуліну є:

А. Амінокислоти

В. Вільні жирні кислоти

С. Глюкоза

D. Фруктоза

Е. Електроліти

2. Тривала гіпоглікемія призводить до незворотніх змін перш за все в:

А. Міокарді

В. Периферичній нервовій системі

С. Центральній нервовій системі

D. Гепатоцитах

Е. Поперечно-смугастій мускулатурі

3. У жінки 52 років розвинулась катаракта (помутніння кришталика) на тлі цукрового діабету. Посилення якого процесу при діабеті є причиною помутніння кришталика?


1   ...   4   5   6   7   8   9   10   11   ...   14


База даних захищена авторським правом ©lecture.in.ua 2016
звернутися до адміністрації

    Головна сторінка