З клінічної біохімії (для студентів фармацевтичного факультету 4 курсу спеціальності «Клінічна фармація»)



Сторінка3/14
Дата конвертації05.11.2016
Розмір2.51 Mb.
1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   14

Емісійна фотометрія - це метод аналізу оснований на вимірюванні енергії, яка випромінюється досліджуваною речовиною в результаті енергетично збудженого стану. До методів емісійної фотометрії відносять: флюориметрію і полум’яну фотометрію.


Флюориметрія основана на ефекті флюоресценції, який виникає в результаті енергетичного збудження досліджуваної речовини під впливом короткохвильового опромінення.

Полум’яна фотометрія. При цьому методі дослідження, як енергетичний агент, що викликає стан збудження досліджуваного речовини, використовують полум’я газової горілки. Іони металів забарвлюють полум’я у відповідності з характерними для них спектрами випромінювання. Щоб виділити випромінювання окремих іонів, застосовують спеціальні світлофільтри, після цього проводять всі необхідні вимірювання.

Явище “холодного світіння” деяких речовин, що викликане зміною електронного стану молекул або атомів, називається люмінесценцією.



Люмінесцентний аналіз, в основі якого лежить флюоресценція, має широке застосування.

Вимірювання інтенсивності флюоресценції залежить від концентрації речовин, що дає змогу проводити кількісне визначення речовин на спеціальних приладах флюориметрах. При цих дослідженнях використовують, як джерело збудження, ультрафіолетове випромінювання.



Електрофорез - це розділення заряджених частинок у електричному полі. Різна молекулярна маса зарядів речовин визначає неоднакову швидкість пересування, що дає можливість їх диференціювати. Швидкість руху іонів підвищується зі збільшенням електрофоретичного заряду, сили електричного поля, але зменшується зі збільшенням радіуса часточок, що рухаються і збільшенням в’язкості середовища. На швидкість руху заряджених часточок впливає температура, з підвищенням якої зростає швидкість руху іонів.

Використовують такі методи електрофорезу :

- фронтальний,

- зональний електрофорез,

- ізоелектричне фокусування,

- імуноелектрофорез.

Фронтальний електрофорез - це розділення речовин у гомогенному розчині без стабілізації зон розподілу. Зональні методи електрофорезу дають змогу отримувати стабільні зони розподілу й класифікуються залежно від середовища, на якому проводяться розділення. Для цього електрофорезу, як середовище, використовують порошки та інші пористі матеріали (крохмаль, целюлозу, полівінілхлорид), гелі (крохмальний, агаровий, поліакриламідний), смуги паперу та інших волокнистих матеріалів.

Зональний електрофорез у залежності від джерела живлення і камери поділяється на горизонтальний і вертикальний (диск-електрофорез).

Імуноелектрофорез належить до найбільш чутливих і сучасних методів імунологічного аналізу. За допомогою цього методу можна визначити число компонентів суміші, а також ідентифікувати ці компоненти за їх електрофоретичною рухливістю, імунологічною специфічністю, а іноді за хімічною природою. За допомогою цього електрофорезу можна виявити компоненти, які здатні давати реакцію преципітації з антитілами, тобто, головним чином, білки і вуглеводи.

Метод імуноелектрофорезу дає можливість дуже точно визначити компоненти складних білкових сумішей за їх імунологічною специфічністю і електрофоретичною рухливістю.



Хроматографія. Для розділення і кількісного визначення білків і амінокислот, нуклеїнових кислот, вуглеводів, ліпідів та інших метаболітів використовують різні методи хроматографії.

Є декілька різновидів хроматографічного методу аналізу.

Найважливіші з них:

адсорбційна хроматографія, що базується на різній здатності окремих сполук адсорбуватися на тих чи інших сорбентах;

іонообмінна - базується на різній здатності речовин, які розділяють, до іонного обміну з тим чи іншим іонітом;

розподільна - заснована на різній розчинності речовин, які розділяють, у двох рідинах, що частково змішуються;

дифузна - заснована на розділенні речовин за швидкістю дифузії в середину сорбента (гель - фільтраційна хроматографія, при якій розділення речовин грунтується на механічному явищі молекулярного просіювання;

хроматографія за спорідненістю (афінна хроматографія) - високоспецифічний метод розділення різних сполук, базується на використанні нерозчинних форм біологічно активних речовин, що мають спорідненість до речовин, які розділяють.



При газовій хроматографії розділення суміші речовин ведуть в атмосфері газу. Адсорбційну, іонообмінну, розподільну, дифузну хроматографію можна проводити в колонках і на площині (на папері і в тонких шарах).

Гель - фільтрація дає змогу розділяти речовини залежно від їх молекулярної маси і форми молекул. Принцип цього методу полягає в тому, що молекули різних розмірів і форм здатні дифундувати в гелі з різною швидкістю. Для гель - фільтрації найчастіше використовують декстранові гелі, які отримали назву сефадексів.

Полярографічний метод засновано на принципі визначення сили струму, яка виникає під час окисно-відновних реакцій, що проходять на зовнішній поверхні робочого електроду. Під час проходження струму в процесі електровідновлення або електроокиснення на полярограмах з’являються ділянки, на яких сила струму пропорційна концентрації реагуючих речовин. Зміна висоти полярограм дає уявлення про концентрацію речовини.

При дослідженні біологічних об’єктів полярографічним методом визначають катіони, аніони, амінокислоти, вітаміни, вуглеводи та інші речовини.

Особливе місце займає полярографічний метод при дослідженні білків, ферментів; за його допомогою можна отримати відомості про деякі функціональні групи білків (-SH, -NH2, імідазольну групу), визначити каталітичну активність ферментів тощо.

Використання манометричного і радіоізотопного методів дозволяють провести дослідження як на рівні клітини, так і на рівні цілого організму.



Імуноферментний аналіз (ІФА).

Імуноаналіз – це метод кількісного визначення речовин, які знаходяться в дуже низьких концентраціях. Цим методом можна визначити будь- які речовини, що викликають утворення антитіл.

Основою цього методу є реакція “ антиген – антитіло”, тобто специфічне зв’язування антитіла з певною речовиною.

Для кількісного аналізу застосовують в основному два види виконання ІФА. Першим етапом їх здійснення виступає зв’язування моноспецифічних антитіл на поверхні твердої фази. Дальше стає можливим проведення реакції конкурентного або непрямого (сендвіч) типу. Антиген, мічений ферментом, конкурує з неміченим досліджуваним антигеном за антитіла на твердій фазі. В іншому варіанті біологічні рідини реагують з імобілізованими на твердій фазі антитілами, після чого решта суміші видаляють і в реакцію вводять мічені ферментом антитіла, які зв’язуються вже імобілізованим антигеном.

Зразки сироватки крові, які містять речовину, що визначають, поміщають у лунки планшету для мікротитрування, на стінках якого сорбовані антитіла, здатні специфічно зв’язувати дану речовину, наприклад гормон. Одночасно в інкубаційну суміш вносять невелику кількість гормону, хімічно зв’язаного з ферментом, так званий кон’югат. Кон’югат і гормон, який визначають, конкурують між собою за зв’язування з обмеженою кількістю сорбованих антитіл. Після цього як зв’язування антигенів відбулося, незв’язані молекули відмивають.

Для визначення кількості зв’язаного кон’югованого антигену в лунки вносять субстратний буфер і забарвлені продукти ферментативної реакції визначають фотометрично. Чим більше гормону в тестованій пробі, тим менше кон’югату буде зв’язуватися з антитілами. Кількісна оцінка здійснюється за допомогою калібрувальної кривої, яку будують за стандартними зразками з відомою концентрацією.



Загальні принципи клініко- біохімічної оцінки результатів обстежень.

До способів рзрахунку результатів дослідження, які використовуються в клінічній біохімії, можна віднести використання умовних одиниць, розрахунки за стандартним (еталонним розчином), розрахунки за калібрувальним графіком, розрахунки за коефіцієнтом перерахунку.



Умовні одиниці використовуються поряд з системними одиницями переважно в методиках, які давно використовуються в лабораторії.

Розрахунки результатів за стандартним (еталонним ) розчином.

Стандартні розчини обробляються одночасно з серією досліджуваного біоматеріалу і знаходяться в цих самих умовах, що й досліджуваний матеріал. Еталонні розчини повинні містити строго визначену концентрацію даної речовини. Розрахунок результатів дослідження, які виконуються зі стандартними розчинами, проводяться за способом пропорції, де за трьома відомими величинами розраховується четверта, досліджувана.

Ест Сст

______ = ______ ,

Едос Сх


де Ест – екстинкція стандартного розчину, Едос- екстинкція досдіжуваної проби, Сст- відома концентрація стандартного розчину, Сх- досліджувана концентрація проби.
1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   14


База даних захищена авторським правом ©lecture.in.ua 2016
звернутися до адміністрації

    Головна сторінка