Методичні вказівки для практичних занять з біологічної хімії



Сторінка1/12
Дата конвертації30.12.2016
Розмір1.56 Mb.
  1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   12


ЛЬВІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ ДАНИЛА ГАЛИЦЬКОГО
КАФЕДРА БІОЛОГІЧНОЇ ХІМІЇ


МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ

ДЛЯ ПРАКТИЧНИХ ЗАНЯТЬ З БІОЛОГІЧНОЇ ХІМІЇ
(для студентів стоматологічного факультету)

(частина 1)

ЛЬВІВ 2010
ЛЬВІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ ДАНИЛА ГАЛИЦЬКОГО
КАФЕДРА БІОЛОГІЧНОЇ ХІМІЇ


МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ

ДЛЯ ПРАКТИЧНИХ ЗАНЯТЬ З БІОЛОГІЧНОЇ ХІМІЇ
(для студентів стоматологічного факультету)

(частина 1)

ЛЬВІВ 2010

Методичні вказівки підготували: доц. Т.І. Бондарчук, доц. Л.І. Кобилінська, доц. Т.М. Макаренко, ас. О.Є. Мазур, доц. Н.В. Фартушок, доц. І.С. Фоменко, ас. О.П. Хаврона.

За редакцією акад. УАН, д-ра мед. наук, проф. О.Я.Склярова
Рецензент: проф. кафедри біоорганічної, біонеорганічної та фармацевтичної хімії Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького В.О. Музиченко


Затверджено на засіданні методичної комісії з хімічних дисциплін та фізики фармацевтичного факультету Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького 15 квітня 2010 року, протокол № 2.


ВСТУП
Біологічна хімія належить до фундаментальних медичних дисциплін, вона базується на вивченні студентами медичної біології, біофізики, медичної хімії, морфологічних дисциплін і закладає основи вивчення студентами молекулярної біології, генетики, фізіології, патології, загальної та молекулярної фармакології, токсикології та пропедевтики стоматологічних дисциплін, що передбачає інтеграцію викладання з цими дисциплінами та формування умінь застосовувати знання з біологічної та біоорганічної хімії, насамперед біохімічних процесів, які мають місце в організмі здорової та хворої людини, в процесі подальшого навчання і професійної діяльності.

Організація навчального процесу здійснюється за кредитно-модульною системою відповідно до вимог Болонського процесу, згідно з яким видами навчальної діяльності є лекції, практичні заняття та самостійна робота студентів.

Методичні вказівки для практичних занять розроблені згідно програми дисципліни «Біологічна та біоорганічна хімія» (Київ, 2010) для вищих медичних закладів освіти України ІІІ – ІV рівнів акредитації, складеної для студентів, що навчаються за спеціальністю "Стоматологія" з урахуванням особливостей викладання на кафедрі біологічної хімії Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького.

Вивчення біоорганічної хімії здійснюється впродовж І або ІІ семестрів 1-ого року навчання, а вивчення біологічної хімії – впродовж ІІІ – ІV семестрів 2-ого року навчання. на вивчення біологічної хімії як навчальної дисципліни виділено 6,5 кредитів (195 год, з них: лекцій – 10 год, практичних занять – 90 год, самостійна робота студентів – 95 год).



Практичні заняття за методикою їх організацій є лабораторними, вони передбачають контроль засвоєння визначеного програмою навчального матеріалу; дослідження по виявленню певних класів біоорганічних сполук за властивостями їх функціональних груп; проведення якісних реакцій та оцінку показників при лабораторному дослідженні розчинів; дослідження клініко-біохімічних показників проміжних інтермедіатів і кінцевих продуктів обміну в основних рідинах організму в нормі та за умов розвитку патологічних процесів; вирішення ситуаційних задач (оцінка клініко-біохімічних показників, що характеризують функції та параметри гомеостазу, встановлення механізмів регуляції метаболічних процесів тощо), що мають експериментальне або клініко-біохімічне спрямування. Кінцеві цілі вивчення навчальної дисципліни «Біологічна та біоорганічна хімія» полягають у тому, що студент в своїй майбутній професійній діяльності повинен вміти:

  • Аналізувати відповідність структури біоорганічних сполук фізіологічним функціям, які вони виконують в організмі людини. Аналізувати реакційну здатність вуглеводів, ліпідів, амінокислот, що забезпечує їх функціональні властивості та метаболічні перетворення в організмі, інтерпретувати особливості будови та перетворень біоорганічних сполук в організмі як основи їх фармакологічної дії в якості лікарських засобів.

  • Інтерпретувати особливості фізіологічного стану організму та розвитку патологічних процесів на основі лабораторних досліджень. Інтерпретувати біохімічні механізми виникнення патологічних процесів в організмі людини та принципи їх корекції.

  • Пояснювати основні механізми біохімічної дії та принципи спрямованого застосування різних класів фармакологічних засобів.

  • Пояснювати біохімічні та молекулярні основи фізіологічних функцій клітин, органів і систем організму людини. Аналізувати функціонування ферментативних процесів, що відбуваються в мембранах і органелах для інтеграції обміну речовин в індивідуальних клітинах.

  • Класифікувати результати біохімічних досліджень та зміни біохімічних показників, що застосовуються для діагностики найпоширеніших хвороб людини, зокрема стоматологічних.

  • Інтерпретувати значення біохімічних процесів обміну речовин та його регуляції в забезпеченні функціонування окремих органів і тканин, зокрема тканин зуба організму людини.


МОДУЛЬ № 2. ЗАГАЛЬНІ ЗАКОНОМІРНОСТІ МЕТАБОЛІЗМУ
Тематичний план практичних занять з модуля 2


№ з/п

Тема

К-кість год

1.

Біологічна хімія як наука, об’єкти вивчення та завдання біохімії, методи біохімічних досліджень.

3

2.

Фізико-хімічні властивості білків-ферментів. Визначення активності ферментів, дослідження механізму їх дії та кінетики ферментативного каталізу.

3

3.

Вивчення регуляції ферментативних процесів та аналіз механізмів виникнення ензимопатій. Дослідження ролі кофакторів і коферментних вітамінів у прояві каталітичної активності ферментів. Медична ензимологія.

3

4.

Основні закономірності обміну речовин. Дослідження функціонування, регуляції та енергетичної вартості циклу трикарбонових кислот.

3

5.

Молекулярні основи біоенергетики.

3

6.

Дослідження анаеробного та аеробного окиснення глюкози

3

7.

Дослідження катаболізму та біосинтезу глікогену. Регуляція обміну глікогену. Біосинтез глюкози – глюконеогенез.

3

8.

альтернативні шляхи обміну моносахаридів. Дослідження механізмів метаболічної та гормональної регуляції обміну глюкози крові. Цукровий діабет.

3

9.

Дослідження біосинтезу триацилгліцеролів і фосфоліпідів. Ліполіз і його регуляція.

3

10.

Бета-окиснення та біосинтез жирних кислот. Дослідження обміну кетонових тіл.

3

11.

Дослідження біосинтезу та біотрансформації холестеролу. Патологія ліпідного обміну.

3

12.

Загальні шляхи перетворень амінокислот у тканинах. Біогенні аміни. Дослідження шляхів утворення та знешкодження аміаку. Біосинтез сечовини.

3

13.

Дослідження спеціалізованих шляхів перетворень амінокислот у тканинах.

3

14.

Підсумковий модульний контроль № 2.

3



Разом годин


42


Завдання для самостійної роботи студентів (СРС)


з/п


Тема

К-кість год

1

Підготовка до практичних занять:




1.1

Набути практичні навички з регуляції метаболізму:




Підготовка матеріалу (біологічні рідини, клітини, субклітинні органели) до проведення біохімічних досліджень.

3

Побудови графіків залежності швидкості ферментативної реакції від концентрації субстрату, змін рН середовища та температури.

3

Пояснювати механізм перетворення субстрату за умов каталітичної дії ферментів.

3

Написання структурних формул коферментних вітамінів і пояснювати механізм утворення їх біологічно активних (коферментних) форм.

3

Пояснювати механізм перебігу ферментативних реакцій за участі коферментів.

3

1.2

Набути практичні навики з молекулярних основ біоенергетики:




Відтворення послідовних етапів спільних шляхів катаболізму білків, вуглеводів і ліпідів.

3

Написання послідовності реакцій перетворення інтермедіатів у циклі трикарбонових кислот.

3

Малювати схему, пояснювати будову та механізм дії ланцюга транспорту електронів.

3

Пояснювати на основі положень хеміосмотичної теорії механізм спряження, окиснення та фосфорилування, синтезу АТФ у дихальному ланцюгу.

1

1.3

Набути практичні навички з біохімії метаболізму вуглеводів:







Написання ферментативних реакцій перетворення інтермедіатів в гліколізі, пентозофосфатному шляху, метаболізмі глікогену.

1

Побудова схем метаболічних шляхів обміну вуглеводів.

1

Пояснювати молекулярні механізми регуляції метаболізму вуглеводів.

1

Оцінювати за біохімічними показниками стан вуглеводного обміну при патрологіях.

1

1.4

Набути практичні навички з біохімії метаболізму ліпідів:







Будувати схеми та писати біохімічні реакції перетворень ліпідів у метаболічних шляхах.

1

Пояснювати молекулярні механізми регуляції обміну ліпідів та окремих метаболічних шляхів.

1

Оцінювати за біохімічними показниками порушення ліпідного обміну при патологічних станах.

0,5

1.5

Набути практичні навички з біохімії метаболізму амінокислот:







Будувати схеми та писати біохімічні (ферментативні) реакції перетворень амінокислот в метаболічних шляхах.

0,5




Аналізувати та трактувати молекулярні механізми регуляції обміну амінокислот та окремих метаболічних шляхів.

0,5




Оцінювати за біохімічними показниками порушення обміну амінокислот при природжених і набутих вадах метаболізму.

0,5

2.

Індивідуальна СРС за вибором (реферат за темою, вказаною в змістовому модулі) - підготовка огляду наукової літератури

10

3.

Підготовка до підсумкового модульного контролю № 2.

10



Разом


53

Оцінку «відмінно» одержує студент, який дав не менше 90 % правильних відповідей на стандартизовані тестові завдання, без помилок відповів на письмові завдання, виконав практичну роботу і обґрунтував одержані результати, тобто: всебічно і глибоко засвоїв навчально-програмний матеріал ; в повному об'ємі володіє теоретичними знаннями та практичними навичками, без помилок вирішує ситуаційні задачі.

Оцінку «добре» одержує студент, який дав не менше 75 % правильних відповідей на стандартизовані тестові завдання, припустився окремих незначних помилок у відповідях на письмові завдання, виконав практичну роботу, але не повно обґрунтував одержані дані, може вирішувати ситуаційні задачі.

Оцінку «задовільно» одержує студент, який дав не менше 55 % правильних відповідей на стандартизовані тестові завдання, припустився значних помилок у відповідях на письмові завдання, виконав практичну роботу, з помилками вирішує ситуаційні задачі.

Оцінку «незадовільно» одержує студент, який дав менше 55 % правильних відповідей на стандартизовані тестові завдання, припустився грубих помилок у відповідях на письмові завдання або взагалі не дав відповідей на них, не виконав практичну роботу та не може правильно інтерпретувати її результати, не вирішує ситуаційні задачі.

При засвоєнні теми за традиційною системою студенту присвоюються бали: «5» - 9 балів; «4» - 7 балів; «3» - 5 балів; «2» - 0 балів.



Максимальна кількість балів за поточну навчальну успішність – 120.

Студент допускається до підсумкового модульного контролю за умов виконання навчальної програми та в разі, якщо за поточну навчальну діяльність він набрав не менше 65 балів (5 балів × 13 занять = 65 балів).

Підсумковий модульний контроль зараховується студенту, якщо він демонструє володіння практичними навичками та набрав при виконанні теоретичного завдання не менше 50 балів.

Максимальна кількість балів за підсумковий модульний контроль – 80.

МОДУЛЬ № 2. ЗАГАЛЬНІ ЗАКОНОМІРНОСТІ МЕТАБОЛІЗМУ
Змістовий модуль 5. Введення в біохімію. Біохімічні компоненти клітини.

Тема №1. Біологічна хімія як наука, об’єкти вивчення та завдання біохімії, методи біохімічних досліджень.

Мета заняття. Ознайомити студентів з предметом і завданнями біологічної хімії та її практичним використанням, методами біохімічних досліджень, які використовуються в клінічній практиці. Оволодіти деякими фізико-хімічними методами дослідження біологічно важливих речовин, а також ознайомитися з апаратурою, що використовується в біохімії. Знати фактори, дія яких призводить до похибки біохімічних досліджень.

Актуальність теми. Біохімія – це наука, яка вивчає хімічний склад живих організмів, будову, властивості, локалізацію та роль наявних у них сполук, шляхи їх синтезу та перетворення, а також притаманні живій клітині хімічні процеси, які в сукупності забезпечують обмін речовин та перетворення енергії.

Через біохімію лежить шлях до розв’язання основних питань природознавства і медицини, зокрема, проблеми синтезу білків, довголіття.

У біохімічних дослідженнях використовують сучасні фізико-хімічні, фізичні та математичні методи. Визначення біохімічних показників використовують для діагностики, моніторингу, лікування та профілактики захворювань.

Конкретні завдання.


  • Знати етапи та закономірності становлення біохімії як фундаментальної медико-біологічної науки та навчальної дисципліни.

  • Знати принципи методів біохімічних досліджень функціонального стану організму людини в нормі та при патології.

  • Використовувати результати біохімічного аналізу для оцінки стану певних ланок обміну речовин.

  • Вміти визначати оптичну густину забарвлених розчинів при різних довжинах хвиль на фотоелектроколориметрі. Правильно інтерпретувати отримані результати.


Теоретичні питання

1. Біологічна хімія як наука. Місце біохімії серед інших медико-біологічних дисциплін.

2 Об’єкти вивчення та завдання біохімії. Провідна роль біохімії у встановленні молекулярних механізмів патогенезу хвороб людини.

3. Зв’язок біохімії з іншими біомедичними науками. Медична біохімія. Клінічна біохімія. Біохімічна лабораторна діагностика.

4. Історія біохімії; розвиток біохімічних досліджень в Україні.

5. Структурно-функціональні компоненти клітин, їх біохімічні функції. Класи біомолекул. Їх ієрархія та походження.

6. Внесок вчених кафедри біохімії Львівського національного медичного університету в розвиток біологічної хімії.

7. Основні методи біохімічних досліджень:

- оптичні методи в біохімії (фотоелектроколориметрія, спектрометрія, спектрофотометрія, флюоресцентний аналіз);

- електрофорез (горизонтальний, диск-електрофорез, ізоелектричне фокусування, імуноелектрофорез);

- хроматографія (афінна, іонообмінна, тонкошарова, газова, гель-хроматографія);

- полярографія;

- манометричний та радіоізотопний методи;

- імуноферментні методи;

- полімеразна ланцюгова реакція, її застосування в наукових і практичних дослідженнях.

8. Принципи забору та збереження матеріалу для лабораторних досліджень. Помилки при проведенні досліджень.


Біохімія як наука виникла на основі розвитку органічної хімії, фізіології та медицини. Вона вивчає хімічні процеси, що відбуваються в живому організмі та відрізняють його від неживого. Живі організми характеризуються наявністю структур, що мають складну високо впорядковану будову й здатні до розмноження та обміну речовин із зовнішнім середовищем.

В історії розвитку біохімії можна виділити 4 періоди:

1. Період практичного використання біохімічних процесів для виготовлення їжі, одягу, предметів домашнього вжитку (з давніх часів до XV ст).

2. Нагромадження біохімічних знань (XV ст. до другої половини XIX ст).

3. Виділення біохімії як самостійної науки (друга половина XIX ст. - початок XX ст).

4. Сучасний період, який характеризується вивченням життєвих процесів на молекулярному та надмолекулярному рівнях.



Напрямки наукової діяльності кафедри біохімії.

Понад 100 років минуло з часу створення кафедри біологічної хімії Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького.

Традиційно склалося так, що наукова діяльність кафедри біохімії була тісно пов’язана з клінічними кафедрами з таких напрямків як гастроентерологія, гепатологія, онкологія тощо.

Наукова робота кафедри біохімії була започаткована у 1894 році професором В. Нєміловичем (1863 – 1904), який став першим завідувачем кафедри.

З 1906 по 1919 рр. кафедрою завідує професор С. Бондзінський. Основним напрямком наукового дослідження кафедри під керівництвом проф. С. Бондзінського були так звані оксипротеїнові кислоти – продукти білкового обміну, які в невеликій кількості виділяються з сечею. У цей період колектив кафедри займався дослідженням жовчних пігментів і продуктів їх обміну, визначав склад фосфору в кістках зубів, досліджувався обмін холестерину в організмі, вплив алкоголю на метаболічні процеси, вивчався склад жирів молока, обмін кофеїну та теоброміну в організмі людини. Співробітниками кафедри було синтезовано і проведено клінічні дослідження препарату „танальбіну”, а також ацетилсаліцилової кислоти та її ефірів. Професор С. Бондзінський є автором близько 30 наукових робіт.

З 1922 по 1941 рік кафедрою біохімії завідував всесвітньо відомий вчений академік АН СРСР Якуб Оскарович Парнас. Заслуги Я. Парнаса полягають у розробці проблеми анаеробного розпаду вуглеводів, які загальновизнані та позначені в біохімічній літературі як теорія Ембдена-Мейергофа-Парнаса або „схема гліколізу ЕМП”. Я. Парнас один з перших у світі використав радіоізотопний метод у біохімічних дослідженнях. Надзвичайне значення мало встановлення Я. Парнасом того факту, що більш високофосфорильовані похідні аденілової кислоти, у вигляді яких вона знаходиться в м’язових волокнах (і в еритроцитах), а саме АТФ і АДФ, на відміну від самої аденілової кислоти не підлягають в клітинах ферментативному дезамінуванню.

Я. Парнасом і його учнями були вивчені біологічні та хімічні властивості м’язової аденілової кислоти та її похідних, запропонований біологічний метод їх кількісного визначення. Я. Парнас був організатором і науковим керівником хіміко-фармацевтичного інституту Львівського університету, а також діючого і зараз Львівського фармацевтичного заводу, деканом медичного та хіміко-фармацевтичного факультетів, директором Львівського медичного інституту. У Львові він згуртував великий колектив молодих талановитих учнів, в результаті дослідницької роботи якого Львівський інститут медичної хімії займав одне з перших місць серед провідних світових центрів біохімії. Колективом було видано понад 300 наукових праць. Я. Парнас є автором близько 170 наукових робіт, в тому числі 5 підручників.

З 1944 по 1973 рр. кафедрою керував професор Богдан Антонович Собчук. Свою наукову діяльність він почав під керівництвом Я. Парнаса, досліджуючи обмін вуглеводів в тканині м’язів і дріжджах. Колективом кафедри під керівництвом Б.А. Собчука проводилися дослідження особливостей обміну вуглеводів у раковій клітині (ефект Кребтрі), а також синтез та вивчення специфічної дії на пухлини ксантоптерину і побічних продуктів цього синтезу – йодоптерину та порфіроптерину; проводися дослідження обміну йоду та функції щитоподібної залози. Було розроблено та впроваджено в клініку новий метод визначення йоду. Досліджувався вплив токсичної дії оксиду вуглецю (чадного газу) на гемоглобін і міоглобін. Б.А. Собчук є автором близько 70 наукових робіт.

З 1974 по 1995 рр. кафедрою завідував проф. Михайло Петрович Шлемкевич. Під його керівництвом на кафедрі біохімії вивчалась проблема ендемічного зобу на біохімічному та гістологічному рівнях. У тісній співпраці з кафедрою онкології вивчався механізм та індивідуальна чутливість резистентних ракових пухлин шлунка людини при застосуванні хіміотерапії, зокрема 5-фторурацилу.

З 1995 по 1998 рр. кафедрою завідував проф. Михайло Федорович Тимочко. Основним напрямком його наукових досліджень було вивчення фундаментальних основ формування адаптаційно-компенсаторних процесів за умов різних експериментальних впливів із акцентом на характер змін кисеньзалежних реакцій, вивчення метаболічних основ підтримання кисневого гомеостазу при різних функціональних станах, а також вирішення широкого кола питань практичної медицини. Вивчався вплив ксенобіотиків на функції органів травної системи, досліджувалася роль енергетичного обміну в патогенезі хронічних захворювань печінки, серцево-судинної системи, проводилося визначення ступеня ризику в абдомінальній, ендокринній та серцево-судинній хірургії, рівня інтоксикації у онкологічних хворих. Професор М. Тимочко є співавтором пріоритетного відкриття, зареєстрованого Міжнародною інформаційною інтелектуальною палатою реєстрації нововведень (1997 р) „Механізм життєзабезпечення високорезистентних до гіпоксій індивідів в експериментальних проявах”. М.Ф. Тимочко є автором близько 450 наукових робіт.

З 1998 року кафедрою завідує професор Олександр Якович Скляров, який є автором близько 250 наукових робіт, зокрема, 7 навчальних посібників, 2 підручників із грифом МОЗ України.

У цей період започаткована наукова співпраця з кафедрою аналітичної хімії Люблінської медичної академії. У 2000 році був підписаний, а у 2007 поновлений договір між кафедрою біохімії ЛНМУ імені Данила Галицького та кафедрою аналітичної хімії Люблінської медичної академії (завідувач проф. Я. Сольський), який передбачає співпрацю у численних напрямках наукової та навчальної діяльності. У рамках вказаної співпраці проведено 6 міжнародних Львівсько-Люблінських конференцій з експериментальної та клінічної біохімії.

У даний час на кафедрі проводяться роботи по вивченню механізмів регуляції органів травної системи, вивчається вплив стресу на цитопротективні та ульцерогенні механізми слизової оболонки органів травлення, метаболічні та іонно-транспортні процеси, досліджується вплив факторів оточуючого середовища на організм, розглядаються питання ендоекології, проводиться розробка нових методів діагностики та лікування.
Загальні правила техніки безпеки при роботі студентів

у навчальній хімічній лабораторії

1. Перебуваючи в хімічній лабораторії, необхідно суворо дотримуватися загальних правил техніки безпеки, враховуючи, що будь-яке порушення може призвести до нещасного випадку.

2. У хімічній лабораторії працювати тільки в медичних халатах та шапочках.

3. На робочому місці залишати тільки необхідні речі (книгу, зошити, ручки), всі інші речі (портфелі, сумки, одяг) зберігати в спеціально відведеному для цього місці, одяг у гардеробі.

4. Кожен студент повинен працювати за закріпленим за ним місцем, перехід на інше робоче місце без дозволу викладача не дозволяється.

5. Категорично забороняється виконувати в лабораторії роботи, не пов’язані із виконанням навчального практикуму.

6. Реактиви після їх використання необхідно ставити на відведене місце.

7. Роботи з концентрованими кислотами, лугами слід проводити обережно, під витяжною шафою, щоб виключити можливість їх потрапляння в очі, а також появу опіків і пошкодження одягу.

8. Бути обережним при роботі з електроприладами. Працювати тільки із заземленим обладнанням.

9. При запалюванні газу кран пальника відкривати поступово.

10. Для уникнення нещасних випадків не працювати з леткими та легкозаймистими речовинами поблизу запаленого пальника.

11. Користуватися горючими і токсичними речовинами (галогени, концентровані кислоти, луги, сірководень тощо), а також проводити досліди, які супроводжуються виділенням шкідливих парів, газів, дозволяється тільки у витяжній шафі.

12. При нагріванні речовин у пробірці не направляти її отвір у бік товариша, який працює, або до себе.

13. Не можна залишати в лабораторії без нагляду ввімкнуті електроприлади, гарячі водяні бані, газові пальники, центрифуги тощо.

14. У випадку пожежі негайно погасити найближчі пальники і гасити вогонь, використовуючи вогнегасник, покривало, пісок.

15. При опіках

а) сильними лугами: необхідно промити уражені ділянки тіла водою і накласти компрес, змочений 1 % розчином оцтової кислоти;

б) сильними кислотами: необхідно промити уражені ділянки тіла водою і накласти компрес, змочений 1 % розчином соди;

в) фенолом: розтерти побілілу від опіку ділянку до нормального стану шкіри, а потім промити водою і накласти пов’язку із гліцерином.

16. У разі потрапляння кислоти або лугу в очі необхідно промити їх великою кількістю води, а потім 2 % розчином соди або борної кислоти.

17. Не виливати в раковину вміст пробірок з концентрованими кислотами та лугами.

18. Не кидати папір, сірники, побитий посуд у водостічну раковину, для цього користуватися смітником.

19. Після закінчення роботи прибрати своє робоче місце, протерти полиці і стіл вологою ганчіркою, поставити посуд з реактивами на відведене місце, виключити воду та газ. Оформити протокол, зробити висновки.

Практична робота

Дослід 1. Визначення оптичної густини (А) розчину, що містить різну кількість фосфору.

Принцип методу. Кожна речовина має свій спектр поглинання з максимумом при певній довжині хвилі. Тому концентрації розчинів різних речовин вимірюють при довжині хвилі, що відповідає максимуму поглинання.

Фосфати в розчині сульфатної кислоти утворюють з молібдатами фосфатно-молібденові комплекси, які відновлюються до молібденової сині. Кількість фосфатів визначають колориметрично (за інтенсивністю забарвлення) за реакцією утворення комплексної фосфатно-молібденової кислоти та її відновлення до молібденової синьки.



Матеріальне забезпечення: стандартний розчин фосфору 0,32 ммоль/л, молібденовий реактив, пробірки, піпетки, ФЕК.

Хід роботи. У п’ять пробірок додають розчини у кількостях, наведених нижче в таблиці:

№ з/п

Назва реактивів

№ пробірок

1

2

3

4

5

1

2

3



4

5


Стандартний розчин фосфору, 0,32 ммоль/л

Дистильована вода, мл

Молібденовий реактив, мл

Концентрація фосфору в пробі, ммоль/мл

Оптична густина


-

5,0


5,0

0


0,5

4,5


5,0

0,16


1,0

4,0


5,0

0,32


2,0

3,0


5,0

0,64


3,0

2,0


5,0

0,96

Розчини змішують і не раніше, ніж через 2 хв, але не пізніше, ніж через 5 хв, вимірюють величину оптичної густини на ФЕКу, використовуючи червоний світлофільтр. За результатами вимірювань будують графік залежності оптичної густини від концентрації фосфору в ммоль/мл.

Зробити висновок. Пояснити вплив концентрацій речовин на величину оптичної густини.


Дослід 2. Кількісне визначення білка в досліджуваному розчині шляхом вимірювання оптичної густини колориметричним методом (біуретова реакція).

Принцип методу. Біуретова реакція характерна для сполук, що містять у своєму складі не менше двох пептидних зв’язків. Такі сполуки в лужному середовищі реагують із міді сульфатом (мідним купоросом), при цьому утворюються сполуки, забарвлені у рожево - фіолетовий колір. В утворенні цього комплексу беруть участь пептидні зв’язки в енольній формі. Біуретова реакція служить підтвердженням наявності пептидних зв’язків у білках та пептидах. Реакція дістала свою назву від біурету (похідне від сечовини).

Матеріальне забезпечення: сироватка крові, калій-натрій виннокислий, міді сульфат, 0,9 % розчин NаCl, 10 % розчин NaOH, мірні пробірки, піпетки на 1; 2 і 10 мл, ФЕК, біуретовий реактив: 0,15 г CuSO4·5Н2О; 0,6 г калію - натрію виннокислого і 50 мл Н2О. Суміш перемішують і додають 30 мл 10 % розчину NаОН, 0,1 г калію йодиду і доводять водою до об’єму 100 мл (зберігають у холодильнику в запарафінованому посуді).

Хід роботи. У першу пробірку вносять 0,1 мл 0,9 % розчину натрію хлориду (контроль), у другу – 0,1 мл стандартного розчину білка (50 г/л), у третю, четверту і п’яту пробірки – по 0,1 мл досліджуваного розчину білка (задачі). У кожну пробірку додають по 5 мл біуретового реактиву, перемішують і через 30 хвилин визначають оптичну густину за допомогою ФЕКу в кюветах завтовшки 10 мм при зеленому світлофільтрі (λ = 500 – 560 нм) проти контрольного розчину.

Розрахунок проводять за формулою: Х= ( С ´ Ад ) / Аст,

де: Х – концентрація речовин у дослідній пробі, г/л;

С – концентрація речовин у стандартному розчині;

Ад – оптична густина досліджуваного розчину;

Аст – оптична густина стандартного розчину білка.

Пояснити отриманий результат. Зробити висновок. Вказати на властивості білків утворювати в лужному середовищі з CuSO4 комплекс рожево-фіолетового забарвлення.

Кількісно загальний білок можна визначити в сироватці або плазмі крові за допомогою тестового набору реактивів напівавтоматичним біохімічним аналізатором „Stat Fах 1904 plus”



Клініко–діагностичне значення. Для кількісного визначення білків у біологічному матеріалі найчастіше застосовують фотоколометричні та спектрофотометричні методи, у деяких випадках – фотонефелометричні методи, а також визначення білка за вмістом загального нітрогену (азотометрія).

У клініко–біохімічних лабораторіях для встановлення діагнозу захворювання проводять визначення концентрації білків у біологічних рідинах організму (крові, сечі, спинномозковій рідині, ексудатах). У нормі вміст загального білка у сироватці крові становить у дорослих 65 – 85 г/л (6,5 – 8,5 %), у дітей до 6 років 56 – 85 г/л (5,6 – 8,5 % ).

Колориметричні методи визначення кількості білків базуються на „кольорових” реакціях на функціональні групи білків: біуретова реакція; мікрометод визначення кількості білка за допомогою реактиву Бенедикта; метод Лоурі; метод Лоурі в модифікації Святкіна (використовують для визначення вмісту білка в препаратах із підвищеним вмістом ліпо- і глікопротеїнів); метод Флореса, метод Бредфорда.

Ультраспектрофотометричний метод визначення кількості білка базується на здатності ароматичних радикалів тирозину, триптофану і меншою мірою – фенілаланіну білка поглинати ультрафіолетове світло з максимумом поглинання при 280 нм.

Визначення вмісту білка сироватки крові рефрактометричним методом, основаним на неоднаковій здатності різних середовищ заломлювати промінь світла, що проходить через них. Відношення синуса кута падіння світла до синуса кута заломлення є постійною величиною і називається показником заломлення. Величина показника заломлення сироватки крові залежить, головним чином, від вмісту в ній білка. Для визначення показника заломлення використовують спеціальні прилади – рефрактометри.
Дослід 3. Визначення наявності білків у розчині методом осадження сульфосаліциловою кислотою.

Принцип методу. Білки легко осаджуються із водного розчину мінеральними, органічними кислотами та солями важких металів. Денатурація і осадження білка кислотами обумовлюється нейтралізацією поверхневого заряду колоїдних частинок білка, руйнуванням гідратаційної оболонки білкових молекул та утворенням комплексних солей білка з кислотами.

Різні органічні кислоти діють на білки по-різному. Особливо чутливою реакцією на наявність білка в розчині є осадження трихлорацетатною та сульфосаліциловою кислотами (чутливість останньої реакції 1 : 50 000). Крім того, сульфосаліцилова кислота поряд з високомолекулярними білками, здатна осаджувати низькомолекулярні білки та продукти розпаду білків – поліпептиди та олігопептиди.



Матеріальне забезпечення: пробірки, розчин білка, 20 % розчин сульфосаліцилової кислоти.

Хід роботи. У пробірку вносять 1,0 мл досліджуваного розчину білка та додають 3 – 5 крапель 20 % розчину сульфосаліцилової кислоти. Спостерігають за утворенням осаду білка.

Пояснити отримані результати. Зробити висновок. Звернути увагу на можливість використання органічних і мінеральних кислот для осадження білків із біологічних рідин.



Клініко-діагностичне значення. Реакція з сульфосаліциловою та трихлорацетатною кислотами використовується для якісного та кількісного визначення білка в сечі.

Здатність білка міцно зв’язувати іони важких металів використовують у клінічній практиці. У разі отруєння солями важких металів (ртуті, свинцю) хворому дають випити велику кількість білка (яєчний білок або молоко). У шлунку утворюються нерозчинні комплекси металів з білками, внаслідок чого припиняється всмоктування отрути в кров, послаблюється інтоксикація та посилюється їх виведення з організму.


Контроль виконання лабораторної роботи

1. Назвати оптичні методи дослідження, які використовують у клінічній біохімії:



А. Фотоелектроколориметричні

В. Афінна хроматографія

С. Флюоресцентний аналіз

D. Полярографія

Е. Імуноферментний аналіз


2. Для виявлення функціональних груп (-SH, -NH2, імідазольних) у білках, ферментах використовують такі методи дослідження:

А. Електрофорез

В. Люмінесцентний аналіз

С. Іонообмінну хроматографію

D. Полярографію

Е. Імуноферментний аналіз

  1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   12


База даних захищена авторським правом ©lecture.in.ua 2016
звернутися до адміністрації

    Головна сторінка