Лекція. 11, 12 Основи використання методу ямр І епр в дослідженні органічних реагентів ямр-спектроскопія високого дозволу



Скачати 470.59 Kb.
Сторінка1/2
Дата конвертації26.05.2017
Розмір470.59 Kb.
  1   2




Факультет Хімічний

Спеціальність Хімія

5 курс

Викладач Жук Л.П.

Дисципліна Спектральні методи дослідження органічних реагентів

Лекція. 11, 12

Основи використання методу ЯМР і ЕПР в дослідженні органічних реагентів
ЯМР-спектроскопія високого дозволу

Можливості методу ЯМР високого дозволу пов'язані з тим фактом, що ядра одного вигляду в різному хімічному оточенні при заданому прикладеному постійному полі поглинають енергію високочастотного поля при різних частотах, що обумовлене різним ступенем екранування ядер від прикладеного магнітного поля. Таке відкриття було зроблене в 1949 р., коли було виявлено, що резонансні сигнали ядер фосфору, азоту і фтору виявляються при різних частотах залежно від того, в які хімічні сполуки входять ці ядра. Відстані між різними резонансними частотами називаються хімічними зрушеннями: за допомогою величин цих зрушень можна отримати інформацію про електронне оточення даного ядра в даній молекулі. Наприклад, якщо досліджується ядерний магнітний резонанс на протонах (протонний магнітний резонанс — ПМР, або ЯМР-Н1), то виявляється, що молекула, що містить тільки один протон або декілька протонів, що знаходяться в одному і тому ж оточенні (наприклад, протони води, бензолу або циклогексану), дає одиночну лінію поглинання. Положення цієї лінії є характеристикою молекули. Оскільки хімічні зрушення не можна вимірювати в абсолютній шкалі, тобто щодо ядра, позбавленого всіх його електронів, то як умовний нуль використовується сигнал еталонного з'єднання (у спектроскопії ЯМР-Н1 часто зручним еталонним з'єднанням служить тетраметилсилан). Зазвичай значення хімічного зрушення для будь-яких ядер приводяться у вигляді безрозмірного параметра, визначуваного таким чином:



де H Нет — різниця хімічних зрушень для досліджуваного зразка і еталону, Нат — абсолютне положення «сигналу еталону при прикладеному основному магнітному полі. Унаслідок неможливості виконати вимірювання поля з необхідною точністю зручніше знаходити з виразу



де  —ет — різниця хімічних зрушень для зразка і еталону, виражена в одиницях частоти (герци); це одиниці, в яких проводиться калібрування спектру. Строго кажучи, слід було б користуватися не частотою 0— робочою частотою спектрометра (зазвичай фіксованою), — а частотою ет , тобто абсолютною частотою, на якій спостерігається резонансний сигнал еталону. Помилка, що проте вноситься при такій заміні, дуже мала, оскільки 0 і ет майже рівні. Оскільки різні ЯМР-спектрометри працюють на самих різних частотах 0, легко можна зрозуміти необхідність виразу в безрозмірних одиницях).

Деякі молекули можуть давати не одну, а декілька ліній поглинання; кожна з цих ліній характеризує електронне оточення магнітних ядер, що досліджуються. Наприклад, спектр ЯМР толуолу складається з двох ліній поглинання, віддалених на 4,85 м. д. Відношення площ ліній (інтенсивностей) відповідає відношенню чисел протонів, що знаходяться в кожному типі оточення. Цю властивість можна використовувати в аналітичних цілях.

Якщо магнітні ядра в з'єднанні розрізняються по своєму хімічному оточенню, то в спектрі може спостерігатися тонка структура ліній поглинання. Ця структура, відома як мультиплетное розщеплювання (мультиплетність), виникає в результаті взаємодії між магнітними ядрами, здійснюваної при допомозі, - електронів зв'язків. Величину взаємодії можна визначити, вимірюючи відстані між компонентами мультиплета; при цьому передбачається, що різниця хімічних зрушень взаємодіючих ядер значно більше, чим величина мультиплетного розщеплювання. Відстані між компонентами мультиплетыв не залежать від напруженості зовнішнього магнітного поля, тому немає необхідності виражати розщеплювання в безрозмірних одиницях: зазвичай для цього використовуються одиниці частоти (герци). Простим прикладом мультиплетного розщеплювання, з яким можна зустрітися, є резонансний спектр молекули, що містить два сорти магнітних ядер А і X. Відстань між компонентами в кожному дублеті називають константою спін-спінової взаємодії (КССВ) JAX. Виникнення дублетів обумовлене тим, що кожне ядро розщеплює резонансну лінію сусіднього ядра на 2I + 1 компонент. Різниці енергій між різними станами спинів такі малі, що при тепловій рівновазі вірогідності цих станів відповідно до больцманівського розподілу виявляються майже рівними. Отже, інтенсивності всіх ліній мультиплета, що отримуються від взаємодії з одним ядром, будуть рівні. У разі коли є п магнітно еквівалентних ядер, резонансний сигнал сусіднього ядра розщеплюється на 2пI + 1 ліній. Для ядер з I=1/2 інтенсивності ліній мультиплета відповідають біноміальним коефіцієнтам, приведеним в наступній таблиці:



п


Відносні інтенсивності компонент мультиплета


1

1

1






















2

1

2

1



















3

1

3

3

1
















4

1

4

6

4

1













5

1

5

10

10

5

1










6

1

6

15

20

15

6

1







7

1

7

21

35

35

21

7

1




8

1

8

28

56

70

56

28

8

1

Величини і характер розщеплювання ліній можна використовувати для визначення відносних положень функціональних груп в молекулі. Додаткові дані отримують за допомогою ізотопного заміщення. Наприклад, якщо водень заміщений дейтерієм (I = 1), то число ліній в мультиплеті спіну зміниться у відповідності зі зміною I. Крім того, унаслідок майже семикратного зменшення гіромагнітного відношення () зменшиться відстань між лініями в даному мультиплеті.

Приведений розгляд застосовний тільки до молекул, для яких  >> J; на жаль, ця умова доволі рідко виконується на практиці. Спектри, для яких вона виконується, називають спектрами першого порядку. Зазвичай спектри складніші, так що визначення значень  і J може займати багато часу.

Досліджуючи залежності зміни ширини і положення ліній від кон­центрації реагуючих речовин і температури, можна отримати дані по кінетиці і термодинамічним характеристикам системи. Типові застосування цього напряму — вивчення водневого зв'язку і конформаційний аналіз. Ще однією корисною особливістю спектрів ЯМР є те, що відносні інтенсивності ліній поглинання дозволяють визначати в дан­ной молекулі відносні кількості магнітних ядер, екранованих різною мірою. Проте для кількісного аналізу спектроскопія ЯМР поки що не використовується.

Отже, ядерний магнітний резонанс представляє значний інтерес для фізичної, органічної і неорганічної хімії. Два види ядер, Н1 і F19, мають ідеальні для ЯМР властивості: високий вміст в природній суміші ізотопів, великий магнітний момент і спин . Тому більшість досліджень виконана з цими ядрами. Значна кількість робіт присвячена також резонансу на ядрах Р31, В11 і С13. Подальше удосконалення методики експерименту привело до широкого застосування методу ЯМР на різних ядрах і особливо на ядрах С13.



Загальна теорія ядерного магнітного резонансу

Квантовомеханічний опис ядерного магнітного резонансу

Якщо ядро з магнітним моментом μ поміщено в магнітне поле, то гамиль­тоніан такої системи має вигляд

H = –μH

а оскільки μ = γI, то

H = – γHI

Власні значення оператора I рівні т, тому власні значення H,, тобто енергії рівнів системи, рівні

E = γmH

Щоб відбулися переходи між енергетичними рівнями, в системі необхідно викликати деяке обурення. Це досягається, наприклад, шляхом дії осцилюючим магнітним полем, необхідний напрям якого можна встановити, виходячи з властивостей операторів спіну і власних функцій ядра із спином I.

Для ядра із спіном I можна ввести набір операторів кутового моменту спіну Ix, Iy, Iz, I2, аналогічний звичнішому набору операторів спіну електрона Sx, Sy, Sz і S2. Власні значення оператора I2 дорівнюють I (I + 1), а Iz мають власні значення, рівні т. Обмежуючись для простоти ядрами із спіном I = ½, отримуємо, що власні значення Iz рівні просто ±½. Тоді два можливі значення енергії (енергетичні рівні) рівні ±½γH, і якщо позначити власні функції спінів буквами  і , то

Iz = + ½;Iz = – ½.

Функції  і  ортонормовані, так що

2 = 2 = 1

і

 =  = 0



Оператори Ix і Iy володіють наступними властивостями:

Якщо осцилююче поле направлене уздовж осі z, то вірогідність переходу між двома рівнями W1 дорівнює нулю:



W1 = |( | Iz | )|2 = 0;

отже, при такому поєднанні напрямів постійного і осцилюю­чого полів переходи між рівнями не відбуваються.

Якщо осцилююче поле направлене уздовж осі х, то

W1 = |( | Iz | )|2 = .

Така ж ненульова вірогідність переходу виходить, якщо осцилююче поле направлене уздовж осі у. Зміна енергії при переході визначається як



отже, частота осцилюючого магнітного поля записується наступним виразом:



що і є умовою резонансу.

У загальному випадку ядра із спіном I вірогідність переходу між енергетичними рівнями т і т1 дається виразом

яке відмінне від нуля тільки при т = т1 ± 1; інакше кажучи, переходи між ядерними енергетичними рівнями підкоряються правилу відбору m = ± 1. Вірогідність переходів для загального випадку ядра із спіном I були обчислені також і методом теорії обурень. Проте застосування такого наближеного методу не є необхідним: як стаціонарний випадок, так і нестаціонарні явища в ядерному магнітному резонансі були чітко розглянуті Швінгером, а також Бейдером для випадку відкритих систем.



Заселеність станів спінів

У оптичній спектроскопії коефіцієнти поглинання не залежать від інтенсивності джерела випромінювання. Це обумовлено тим, що поглинаюча система зазвичай швидко повертається із збудженого стану в основний, а звільнена при цьому енергія розсівається у вигляді тепла. На відміну від цього в спектроскопії ядерного магнітного резонансу при великій інтенсивності опромінювання (тобто при великій амплітуді радіочастотного поля) може спостерігатися ослаблення або навіть повне зникнення сигналу поглинання. Це явище — наслідок ізоляції ядер від грат, що оточують їх. У рідині ядро може залишатися ізольованим протягом декількох секунд, а в твердих тілах при низьких температурах цей час може доходити до декількох годин. Проте (хаотичні) магнітні поля, що флуктуюють, пов'язані з міжмолекулярними або внутрішньомолекулярними рухами в зразку, містять компоненти з частотою, рівній частоті резонансу, які викликатимуть переходи в основний стан. Для більшої частини електромагнітного спектру вірогідність вимушеного випромінювання (або поглинання), що індукується опромінюванням, нехтувано мала, тоді як для ядерного магнітного резонансу ця вірогідність велика. В той же час вірогідність спонтанного випромінювання в порівнянні з вимушеним нехтувано мала (так, час життя збудженого стану для протона складатиме близько 1018 років). Внаслідок цього опромінювання зразка інтенсивним радіочастотним полем швидко зрівнюватиме заселеності енергетичних рівнів. Між рівнями встановиться динамічна рівновага, і ніякого поглинання спостерігатися не буде.

Якщо розподіл ядер по станах спінів слідує закону Больцмана, то при використанні малоінтенсивного випромінювання, що має резонансну частоту, можна спостерігати результуюче поглинання енер­гії. У разі сукупності слабо зв'язаних однакових ядер із спіном ½ енергетичні рівні, отримані для ізольованого ядра, можна віднести до всієї сукупності в цілому. При цьому слід припустити, що ядра не взаємодіють з іншими частинами системи. Якщо вся сукупність ядер знаходиться в тепловій рівновазі, то відносні заселеності два енерге­тичних рівнів підкоряються співвідношенню

де N2 і N1 — числа ядер відповідно на верхньому і нижньому енергетичних рівнях, k — стала Больцмана, Т — абсолютна температура. Відстань між енергетичними рівнями рівна



отже


(1)

Звідси для протонів в полі 10 000 е надлишок заселеності нижнього стану рівний



При розгляді виразу (1) стає очевидною доцільність підвищення напруженості основного магнітного поля до максимально досяжного значення: при цьому не тільки збільшуються відстані між енергетичними рівнями, але одночасно унаслідок збільшення надмірної заселеності нижнього рівня підвищується чутливість методу. Можливість спостереження поглинання при ядерному магнітному резонансі визначається результуючим поглинанням енергії завдяки цьому невеликому надлишку заселеності. При безперервному поглинанні відносний надлишок зменшується. Відношення заселенностей як і раніше можна описувати за допомогою больцманівського множника, проте вхідну в нього температуру необхідно відповідно збільшити. Це значення Т називають температурою спіну, а підвищення її при опромінюванні можна розглядати як високочастотний нагрів системи спіну. Слід звернути увагу на особливості поняття температури спіну, оскільки якщо відбувається високочастотне охолоджування і є надлишок ядер на вищому енергетичному рівні, то температура спіну може набувати негативних значень. Лінія розділу ділянок позитивних і негативних температур відповідає рівній заселеності всіх енергетичних рівнів; статистично такий стан відповідає нескінченно великій температурі. Тому при переході від позитивних температур до негативних системи не проходять через абсолютний нуль. Оскільки негативний абсолютний нуль температури можна визначити як стан з повною заселеністю верхнього енергетичного рівня, він так само недосяжний, як і звичайний позитивний абсолютний нуль.

Вірогідність знаходження даного ядра на верхньому або нижньому рівнях рівна відповідно ½(1 — H/kT) і ½(l + H/kT). Наслідком нерівномірного розподілу ядер по рівнях буде поява результуючого макроскопічного магнітного моменту у напрямі зовнішнього магнітного, поля. Середній ядерний магнітний момент в цьому напрямі дається виразом

Якщо в одиниці об'єму є N ядер, то об'ємна парамагнітна сприйнятливість записується таким чином:



При кімнатній температурі 0 має величину всього біля 3·10-10, так що ядерні ефекти нехтувано малі порівняно з електронною діамагнітною сприйнятливістю, величина якої близько 10-6. У загальному випадку для ядра із спіном I



.

Хімічне зрушення

Сукупність магнітних ядер із спіном I, поміщених в магнітне поле Н, поглинає енергію електромагнітного випромінювання, що має частоту



. (2)

Хімічне зрушення спостерігається в тих випадках, коли два або декілька ядер одного ізотопу знаходяться в разному хімічному оточенні; зазвичай кож­на група ядер, що відрізняється від інших, дає окремий сигнал резонансного поглинання, причому інтенсивність сигналу пропорційна числу однако­вих ядер в групі. Ядра можуть бути магнітно різними або тому, що вони входять в хімічно різні групи, або унаслідок різниці в про­сторовому оточенні.

Значення хімічного зрушення лінійно зростає при збільшенні напруженості прикладеного магнітного поля. Зрушення обумовлене діамагнітним екрануванням ядра навколишніми електронами. У магнітному полі з напруженістю H0 електрони прецесують навколо напряму поля з ларморовою частотою еН0/2Мс, утворюючи кругові електричні струми, які створюють в місці розташування ядра вторинне магнітне поле, направлене назустріч Но. Те, що в молекулах і фрагментах молекул виникають електричні струми, що було експериментально показане на прикладі молекули бензолу, в якій під впливом сильного магнітного поля виникає круговий циклічний струм. Величина H у виразі (2) є напруженістю поля в місці розташування ядра; вона відрізняється від прикладеного поля Hо на величину H', тобто

H = H0 – H'

або


H = H0(1 – ),
де  — безрозмірне число, зване константою екранування. Якщо два ядра одного ізотопу в оточеннях i і j мають константи екранування i і j, то різниця хімічних зрушень ij рівна

ij = i – j.


Величина ij для даного ізотопу залежить від атомного номера ізотопу; у протонному резонансі діапазон хімічних зрушень близько 10 м. д., а в резонансі на фторі — більше 600 м. д.

Вимірювання абсолютних хімічних зрушень неможливе, оскільки воно означало б порівняння резонансної частоти ядра даного ізотопу, що входить в певну молекулу, з резонансною частотою цього ж ядра, позбавленого всіх його електронів. У більшості хімічних застосувань ЯМР потрібно знати тільки значення зрушень, зміряних щодо деякого еталонного з'єднання. При спостереженні протонного резонансу як еталонні з'єднання використовуються вода, бензол і, найчастіше, тетраметилсилан Si(CH3)4. Хімічним зрушенням називають безрозмірне число



де Hс — напруженість поля, відповідного резонансному поглинанню даного ядра в даному оточенні, а Нет — напруженість такого поля для еталонного з'єднання.

У деяких з'єднаннях хімічне зрушення залежить від температури; це указує, взагалі кажучи, на наявність деякого процесу усереднювання, наприклад обміну ядер між місцями з різними константами екранування або загальмованого обертання навколо зв'язків. Це дозволяє також знаходити бар'єри інверсії і обертання в конформаційно рухомих з'єднаннях.

Спін-спінова взаємодія

Розглядаючи спектри, отримані при високому дозволі, часто можна відмітити, що сигнали від груп ядер з різними хімічними зрушеннями самі складаються з декількох ліній. Ця мультиплетність вперше була відмічена Проктором при спостереженні резонансу Sb121 в з'єднанні NaSbF6. Ретельне очищення цього з'єднання дозволяло вважати, що була присутня тільки одна форма сурми, проте спостерігалося сім рівновіддалених ліній з відношенням інтенсивностей 1:6:15:20:15:6:1 (у оригінальній роботі повідомлялося про 5 ліній, проте Гутовський і Мак-Колл відзначили наявність в спектрі ще двох ліній).

Систематичне вивчення мультиплетного розщеплювання показало, що тонка структура може виникати в будь-якій молекулі, в якій є два або декілька ядер, що дають резонансні сигнали при різних напруженостях поля. Очевидно, це можуть бути або ядра різних елементів або ізотопів, або ядра одного ізотопу з різним хімічним зрушенням. Число ліній в спектрі ядра А, що входить в молекулу Ахп (де А і X не еквівалентні), рівне 2nIX + 1, де IX — квантове число спіну ядра X, а інтенсивності ліній визначаються біноміальними коефіцієнтами n-го ступеня. Лінії, що входять в мультиплет, еквідістантні; величина розщеплювання називається константою спін-спінової взаємодії і позначається символом JAX. Значення JAX зазвичай приводять в герцах. Для пояснення приведеного вище за правило розглянемо два прості приклади спектрів з мультиплетными списами.

Спектр протонного резонансу газоподібного водню містить одиночну лінію, оскільки два ядра в молекулі водню магнітно еквівалентні. Проте в спектрі протонного резонансу газоподібного дейтероводорода HD спостерігають три рівновіддалені лінії однакової інтенсивності, що виникають унаслідок взаємодії протона з ядром дейтерію, для якого I = 1. Спектр резонансу на дейтерії є симетричним дублетом; константа спін-спінової взаємодії для обох спектрів однакова і рівна 43,0 гц . Слід відмітити, що якби константа взаємодії вимірювалася в одиницях напруженості поля, то розщеплювання в спектрах різних ядер не були б рівні, а відносилися б як γHDH і γD — гіромагнітні відношення для протона і дейтрона). Спектр ПМР 2-фенілетоксиаміна показаний на мал. 2. Піки від метиленових груп є триплетами унаслідок взаємодії протонів сусідніх груп, а сигналом аміногрупи є синглет, оскільки ядра атомів водню в ній достатньо віддалені від ядер водню метиленових фрагментів атомом кисню.

Для спін-спінової взаємодії характерні наступні властивості:


  1. Між групами еквівалентних ядер взаємодія не спостерігається. «Еквівалентність» тут означає не просто еквівалентність, пов'язану з симетрією молекули, а також те, що еквівалентні ядра повинні однаково взаємодіяти з рештою всіх ядер в молекулі. Наприклад, чотири атоми водню в плоскій молекулі етилену еквівалентні, і в спектрі спостерігається тільки одна лінія. З іншого боку, два протони в 1,1-дифторетилені

аналогічні по симетрії, але магнітно нееквівалентні, оскільки по-різному взаємодіють з атомами фтору F(l) і F(2).



  1. Константа взаємодії не залежить від напруженості прикладеного магнітного поля.

  2. Величина константи взаємодії між двома ядрами із збільшенням атомного номера обох ядер зазвичай зростає. У протонному резонансі типові значення констант взаємодії JHH бувають близько 10 гц, а в спектрах F19 JFF може досягати 300 гц. Константи взаємодії для ядер різних ізотопів зручніше порівнювати, заздалегідь виразивши їх значення щодо протонів, тобто помноживши J на γHX.

  3. Величина константи взаємодії JAX, як правило, убуває із зростанням числа хімічних зв'язків, що відокремлюють А від X. Зазвичай якщо число зв'язків між А і X більше 5, то JAX стає практично рівною нулю; проте відомі виключення з цього правила.

  4. Константа взаємодії не залежить від температури.

Був запропонований механізм мультиплетного розщеплювання, в якому вважалося, що взаємодія протікає через валентні електрони. Дію цього механізму найзручніше розглянути на прикладі молекули типу HD. Електрони обох атомів прагнуть орієнтуватися так, щоб вектори їх магнітних моментів були антипараллельны векторам магнітних моментів ядер. Крім того, обидва електрони, що беруть участь в ковалентному звязуванні, прагнуть орієнтувати свої спіни, а отже, і вектори магнітних моментів також антипараллельно. Таким чином, два вектори магнітних моментів ядер в молекулі HD прагнуть розташуватися антипараллельно. Важливо відзначити, що запропонований механізм взаємодії пояснює, як орієнтація одного ядра впливає на інше, але не може, проте, пояснити наявність більш ніж одного енергетичного рівня. Якщо відбувається повне спаровування електронів, то може існувати тільки одна конфігурація відносного розташування ядер, а саме з антипаралельними спінами. А щоб могло існувати більш за один енергетичний рівень, тобто більш за одну лінію в спектрі, повинні існувати збуджені електронні стани молекули, в яких можливі інші відносні орієнтації ядер. У описаному вище жорсткому механізмі це означає, що мають бути стани, в яких беруть участь електрони з паралельними спінами. Цей простий механізм взаємодії можна описати членом hJijμi·μj в гамільтоніані взаємодії, де Jij константа, що не залежна від температури і має розмірність частоти. Число і відносні інтенсивності ліній в мультиплетах залежать від поєднань спінів у взаємодіючих групах. Як приклад розглянемо молекулу СН3СН2Х, де X не приймає участі в спін-спіновій взаємодії. Протон має I = ½, тому можливі для нього стани спінів визначаються магнітним квантовим числом m, рівним ±½. Позначимо стан т = + ½ буквою , а стан т = – ½ буквою .

Протони метиленової групи беруть участь у взаємодії з чотирма енергетичними станами групи СН3, відповідними чотирьом значенням загального спину. Двом станам із загальним спином ±½ відповідає втричі більше число поєднань спінів, чим станам із загальним спіном ±1,5. Тому сигнал резонансу від групи СН2 є квартетом з відносними інтенсивностями ліній 1 : 3 : 3 : 1. Два протони групи СН2 можуть мати наступні стани спінів:









Загальний спін


1



+1

2



0



0

3



–1

Тому сигнал від групи СН3 розщеплюється на 3 лінії з відносними інтенсивностями 1:2:1.

Аналіз спектрів за допомогою приведених вище простих правил можливий тільки для систем, в яких хімічне зрушення велике в порівнянні з констан­тою взаємодії. Якщо різниця хімічних зрушень для двох груп ядер одного порядку з константою взаємодії між групами, то число і відносні інтенсивності ліній в спектрі вже не підкоряються цим про­стим правилам. Для аналізу спостережуваних в цьому випадку складних спектрів необхідне докладніше дослідження методами квантової механіки.

Як у органічій хімії, так і в біохімії ЯМР-спектроськопія є перш за все аналітичним методом, за допомогою якого можна або підтвердити, або спростувати передбачувану структуру нових синтезованих сполук. Окрім цієї сфери застосування ЯМР, орієнтованою перш за все на хімічні додатки методу, можна отримати також інформацію про просторове розташування атомів, конфігурацію біологічно важ­ливих молекул і молекулярних комплексів. Така інформація дозволяє внести істотний внесок до з'ясування механізмів ферментативних перет­ворень і шляхів проходження біохімічних реакцій.

Застосування ЯМР спектроскопії в біохімії

1. ЯМР малих молекул

Віднесення всіх резонансних ліній і необхідний дозвіл в спектрах досягається досить просто

- хімічний аналіз

- визначення невідомих хімічних структур

- неінвазивне визначення концентрацій

- дослідження шляхів протікання реакцій і продуктів реакцій

- визначення констант зв'язку

- конформації субстата на активному центрі.

2. ЯМР макромолекул

Віднесення резонансних ліній і досягнення необхідного дозволу

- достатньо складне завдання

- зміна конформації молекул під впливом зовнішніх дій (рН, температура, іонна сила, тиск і так далі)

- конформаційні зміни при утворенні зв'язку з субстратом

- структура активного центру ферментів, просторове розташування бічних ланцюгів щодо субстрату, іонізація функціональних груп

- визначення тимчасових характеристик (часу кореляції) і характеру руху при локальних і глобальних конформаційних змінах

- взаємодія між молекулами фермент-субстрат, протеїн-протеїн, протеїн-нуклеїнова кислота

- визначення вторинної структури в розчині, - визначення третинної структури в розчині.

Перевагою методу ЯМР, що особливо істотно в медичних застосуваннях, є низька енергія використовуваних квантів РЧ. Навіть при максимальних значеннях магнітних полів, вживаних в даний час, енергія цих квантів близько 4 • 10-25 Дж, що набагато менше енергії, необхідної для руйнування ковалентних хімічних зв'язків; типове значення енергії хімічних зв'язків по порядку рівного 10-17 Дж. На відміну від методів, в яких використовується іонізуюче випромінювання, ЯМР є неруйнуючим методом.

ЯМР як аналітичний метод

На різноманітних прикладах показано, яким чином ЯМР може бути використаний як аналітичний метод.

Застосування методу ЯМР як аналітичний можна продемон­струвати на прикладі простої молекули - молекули етанолу, оскільки, протонам трьох функціональних груп в етанолі: метильною, метиленовою і гідроксильною відповідають три різні ре­зонансні лінії, спостережувані в спектрі. Особливість методу ЯМР перш за все полягає в тому, що по положенню резонансних ліній в спектрах можна судити про взаємне розташування окремих атомів або груп атомів в молекулах, причому це вдається виявити навіть для еквівалентних атомів. ЯМР по своїй інформативності вигідно відрізняється від багатьох інших ана­літичних методів, що конкурують з ним.

В той же час ЯМР є досить малочутливим методом, не дивлячись на те що в сучасних спектрометрах значення максимально досяжного магнітного поля складає 14 Тл, що відповідає робочій частоті для Н 600 Мгц. Мінімальна кількість речовини, яка може бути зареєстроване за допомогою методу ЯМР Н, варіюється в широких межах залежно від умов експерименту. Для малих молекул ти­пове значення, що визначає межу чутливості, складає 10 нмоль, тобто та кількість речовини, яка може бути проаналізова­на простими біохімічними методами, наприклад, за допомогою тонкошарової хроматографії. При використанні інших, досить широко використовуваних методів, таких, як газова хроматографія або радіоіммунометрія, стають доступними принципово інші з погляду чутливості області такі, як фемто- і атоммолярна. Таким чином, якщо мова йде тільки про реєстрацію спектрів речовин відомої структури, то ці методи по чутливості перевершують ЯМР. Перевага ЯМР стає очевидним лише тоді, коли виникає необхідність в отриманні додаткової інформації, яку може надати тільки цей метод. Це стосується тих випадків, коли структура досліджуваної речовини ще не відома. Тоді з аналізу спектру ЯМР можна побудувати ряд можливих структур і вибрати серед них правильну. Слід зазначити також ще одну особливість методу ЯМР: у спектрах ЯМР І можуть бути присутніми сигнали молекул-домішок, ідентифікація яких можлива тільки у разі застосування спеціальних методів.
Ідентифікація відомих і невідомих речовин

Використання методу ЯМР як аналітичного в простому випадку полягає в порівнянні положень ліній спектрів зразка невідомої структури і стандартного зразка відомої структури: збіг спект­рів стандартної речовини і досліджуваної дозволяє провести ідентифікацію останньої. На підставі такого роду зіставлень можна дати навіть кількісну оцінку концентрації речовин, що містяться в зразку. Ця оцінка в простому вигляді може бути сформульована таким чином: речовина А міститься в зразку в концентрації, достатній для його реєстрації. Правда, такий спосіб оцінки справедливий лише тоді, коли обидва порівнювані спектри отримано за ідентичних умов. Реальний спектр, відповідний певній речовині, істотно залежить від умов його реєстрації. Вид спектру визначається не тільки зовнішніми чинниками (температурою в датчику ЯМР, напруженістю поля і використовуваною імпульсною послідовністю), тобто тими параметрами, які експериментатор може контролювати самостійно, але й використовуваним розчинником. Не дивлячись на це, все ж таки вдається провести ідентифіка­цію невідомої речовини, оскільки завжди можна обмежитися певним абстрактним рівнем і порівняти характерні особливості спектрів.

Розглянемо ще раз фрагмент спектру ЯМР етанолу, знятого на сучасному ЯМР-спектрометрі з високим значенням постійного магнітного поля (рис.2.1). Параметри, що повністю характеризують спектр: положення спектральних ліній, структура мультиплетів і відносні інтенсивності резонансних ліній. Положення ліній визначається значенням хімічного зрушення, а розщеплювання ліній - скалярною спін-спіновою взаємодією. Площа під резонансним сигналом, яка може бути отримана чисельною інтеграцією (див. рис.2.1), про­порційна числу спінів, відповідних даній групі в молекулі.

Хімічне зрушення можна розуміти як поси­лення або послаблення зовнішнього магнітного поля в точці простору, в якій розташоване досліджуване ядро. Основний внесок у величину цієї локальної зміни поля дають електронні оболонки даних молекул, тому можна стверджувати, що хімічне зрушення відображає структуру молекул. Якщо оцінювати вплив заступників на величину хі­мічного зрушення, то із зростанням числа зв'язків між даним атомом і замісником цей вплив зменшується. Проте характер електронного розподілу, а значить, і вид спектру ЯМР, залежить і від просторової структури молекул, і від взаємодії з іншими молекулами в розчині, тобто від тих чинників, які вже не представляються такими очевидними.

Для ЯМР область значень хімічних зрушень невелика (табл.2.2), а ефекти, пов'язані з просторовою структурою і викликані взаємодією з іншими молекулами, бувають настільки великі, що часто із спостереження спектрів ЯМР вельми скрутно зробити однозначний вивід про хімічну структуру речовини.
Таблиця 2.2. Хімічне зрушення в спектрах 1Н і 13С

Група


Область значень хімічних зрушень  в м.д.

відносно ТМС




1Н-ЯМР

13С-ЯМР

-С-СН3 (звичайний метил)

0,1-1,8

5-35

-S-CH3 (тіометил)

1,5-3,8

10-20

-О-CH3 (метокси)

2,6-4,2

45-60

-С-СН2-С (метиленовий)

0,3-3,9

15-55

-S-CH2-C (метиленовий)

1,6-4,8

25-45

-О-СН2-С (метиленовий)

3,2-4,8

40-70

2-СН-С (метиновий)

0,8-2,6

30-60

3-С-С (третинний вуглець)

-

25-50

-СН=СН-С (алкеновый вуглець)

5,0-7,0

105-145

-СН=СН-С- (ароматичний)

5,0-10,0

115-145

-C-CH=N- (гетероциклічний)

5,0-10,0

145-155

С-С- (алкиновый)



75-95

-С-СНО (альдегідний)

9,4-11,0

185-210

-С-СООН (кислотний)

4,6-14,0

170-185

-C-CO-NH (пептидний зв'язок)

6,5-11,0

170-185

Для більшості молекул в розчині конформація їх при кімнатній температурі не є жорсткою, вони можуть існувати у вигляді декількох різних конформацій. Встановлювана конформаційна рівновага залежить від складу розчинника, температури і тиску. Крім того, досліджувані молекули можуть взаємодіяти між собою або з іншими молекулами і утворювати при цьому більш менш стабільні комплек­си. Вірогідність виявлення цих взаємодій залежить від концентра­ції всіх компонентів, присутніх в розчині.

На відміну від спектрів ЯМР Н діапазон значень хімічних зрушень в спектрах С істотно більше (див. табл.2.2), так що положення резо­нансних ліній в спектрах С визначається в основному хімічною будовою. Значення хімічних зрушень характеристичні за умови, що вплив замісників враховується у вигляді аддитивної поправки до величини хімічного зрушення.



Внутрішній і зовнішній стандарт

Хімічне зрушення, як правило, приводит­ься щодо резонансної частоти (сигналу) речовини-стандарту, яка додається в досліджуваний розчин (внутрішній стандарт) або поміщається в капіляр (зовнішній стандарт). В цьому випадку, як показано раніше, хімічне зрушення залежить від резонансної частоти використовуваного стандарту. Величина хімічного зрушення має сенс тільки у випадку, якщо вказаний стандарт, щодо якого приводиться його значення. У табл.2.3 приведені основні речовини, використовувані як стандарти. Якщо ж хімічне зрушення приведене щодо іншої речовини, використовуваної як стандарт, то її значення завжди можна перерахувати відносно загальноприйнятого стандарту.

Як зовнішній, так і внутрішній стандарти мають ряд переваг і недоліків. Внутрішній стандарт може вступати у взаємодію з іншими молекулами, присутніми в розчині, що приводить до зрушення сигналу стандарту, тобто до зрушення нульової крапки. Взаємодія стан­дарту з досліджуваною речовиною також може привести до зміни виду його спектру. Тому основною вимогою, що пред'являється до внутрішнього стандарту, є зменшення цього ефекту. Очевидно, що внутрішній стандарт має бути хімічно стабільним з'єднанням і добре розчинним у використовуваному розчиннику. Всім цим умовам цілком задовольняють такі речовини, як тетраметилсилан (ТМС), 2,2-диметил-2-силапентан-5-сульфонова кислота (ДСС) і триметилсилилпропионова кислота (ТСП) (див. табл.2.3), положення сигналу метальної групи для яких використовується як нульова крапка в шкалі хімічних зрушень і м.д. Ці речовини використовуються як стандарти в спектрах як Н, так і С. Для інших ядер, спектри яких представляють інтерес з погляду біологічних застосувань ЯМР таких, як N і Р, поки не встановлений єдиний стандарт.

Зовнішній стандарт відокремлений від досліджуваної речовини. Як правило, його запаюють в капіляр і поміщають у вимірювальну ампулу. Очевидною перевагою використання зовнішнього стандарту є те, що молекули стандартної речовини і досліджуваного не взаємодіють. Проте тут виникає інша проблема, пов'язана з тим, що магнітні сприйнятливості розчинника усередині капіляра і в образі розрізняються. Величина магнітного поля в точці розташування ядра визначається не тільки екрануючим впливом електронних оболонок, але і зовнішнім магнітним полем В, величина якого залежить від магнітної сприйнятливості оточення. Якщо використовується внутрішній стандарт, то зміна магнітного поля за рахунок сприйнятливості оточення однаково і для молекул стандарту, і для молекул досліджуваної речовини. При використанні зовнішнього стандарту ця умова не виконується. Залежно від магнітних сприйнять досліджуваної речовини і стандарту їх ядра знаходяться в різних магнітних полях, причому це відмінність у величині полів залежить не тільки від магнітних сприйнять Хprobe досліджуваної речовини Хref речовини-стандарту, але і геометричних чинників. У ЯМР високого дозволу зразок і стандарт поміщають, як правило, в циліндрові ампули-капіляри, довгі осі яких паралельні зовнішньому магнітному полю. Відмінність в значеннях зовнішнього магнітного поля для зразка і стандарту можна розрахувати по наступній формулі:



Поправка на сприйнятливість виявляється особливо істотною, якщо проводиться порівняння спектрів, отриманих на спектрометрі зі зверх­проводящим магнітом і із звичайним електромагнітом. У останньому випадку зразки зазвичай розташовують перпендикулярно зовнішньому магнітному по­лю; згідно теоретичним розрахункам коефіцієнт -4/3 у рівнянні (2.1) слід замінити на 2/3.

Таким чином, навіть для однакових зразків без урахування поправки на магнітну сприйнятливість значення хімічних зсувів відрізнятимуться.

Для зразка сферичної форми магнітне поле усередині і поза ним од­наково, так що проблему, пов'язану із зовнішнім стандартом, можна частково обійти, якщо помістити стандарт в сферичний капіляр.



Мультіплетна структура

Другою важливою властивістю спектрів ЯМР, що дозволяє отримати повнішу їх характеристику, є мультиплетна структура ліній. Параметр J, що кількісно характеризує розщеплювання резонансних ліній, називається константою зв'язку. Величина J називається константою гомоядерної взаємодії, якщо розглядається взаємодія між ядрами одного сорту, і константою гетероядерної взаємодії, якщо взаємодіючі ядра належать ядрам різних елементів. Розщеплювання резонансних ліній, показане на рис.2.1, відображає гомоядерну взаємодію між протонами, які входять до складу різних хімічних груп в етанолі. Етанол складається не тільки з атомів водню, але і атомів вуглецю і кисню, проте константа гетероядерної взаємодії не може бути виявлена по спектрах ЯМР, оскільки ізотопи 12С і 16О мають нульовий спін. При детальнішому розгляді спектру можна спостерігати дуже слабкі додаткові лінії по обидві сторони від основної - так звані сателіти С. Ці лінії виникають за рахунок взаємодії протонів з ізотопом вуглецю З, природний зміст якого складає близько 1 % і спин I = 1/2.

Мультіплетна структура спектрів ЯМР може бути розрахована теоретично. Розроблений ряд достатньо досконалих програм побудови спектрів, які дозволяють по відомих значеннях констант спін-спінової взаємодії і хімічних зрушень провести розрахунок теоретичного спектру. Як вже обговорювалося в розділі 1, у разі слабкого зв'язку характер розщеплювання можна описати досить просто, і навпаки, виходячи з характеру розщеплювання резонансних ліній, можна розрахувати, скільки спинів бере участь у взаємодії і яка структура даної хімічної сполуки. При змішуванні етанолу з дейтерованою водою протони гідроксильної групи етанолу заміщаються на ядра дейтерію. У спектрі зникає сигнал, відповідний протонам гідроксильної групи і одночасно зникає взаємодія протонів гідроксильної групи і протонів СН2-группи. Протони, що входять до складу СН2- і СН3-групп в межах групи магнітно еквівалентні. Це відповідає системі спину А2Х3.

Інтенсивність компонент мультиплета також можна розрахувати по простих правилах, аналогічних правилах розрахунку мультиплетної структури. В принципі за допомогою ітеративної процедури можна отримати співвідношення інтенсивностей ліній усередині мультиплета для кожної резонансної лінії. Взаємодія даного спину з п еквівалентними ядрами із спином 1/2 викликає розщеплювання резонансної лінії на (п+1) компоненту, інтенсивність кожній з компонент описується біноміальними коефіцієнтами . Інтенсивність Iт т-й компоненти (m=1..., п) в цьому випадку можна розрахувати по формулі



В цьому випадку для СН3-группи етанолу (n = 2) отримаємо мультиплет з відношенням інтенсивностей 1:2:1.

Ситуація істотно ускладнюється, якщо не виконується наближення слабкого зв'язку. На рис.2.2 показана зміна виду спектру для випадку простою системи спину АХ, такою, що складається з двох взаємодіючих ядер А і X із спинами I = 1/2, за умови, що константа непрямої спін-спінової взаємодії JAX залишається незмінною, а різниця значень хімічних зрушень  (зміряна в Гц) зменшується. У межі достатньо сильного зменшення різниці хімічних зрушень реалізується наближення сильного зв'язку. Відповідно до загальноприйнятої номенклатури використання букв, наступних одна за одною в алфавітному порядку, для позначення системи спину означає наявність сильного зв'язку, наприклад, АВ замість АХ, відповідного слабкому зв'язку. Якщо хімічне зрушення, як завжди, вимірювати в м.д., то величина хімічного зрушення не залежить від напруженості магнітного поля. Саме на цьому засновано використання такої шкали (у м.д.). Проте якщо хімічне зрушення вимірювати в Гц, то ця величина зростає із збільшенням напруженості зовнішнього магнітного поля. Різниця хімічних зрушень, виражена в одиницях частоти, зростає із збільшенням напруженості магнітного поля, а константа спін-спінової взаємодії не залежить від цієї напруженості. Отже, при збільшенні поля ми від наближення сильного зв'язку переходимо до наближення слабкого зв'язку (рис.2.2). Слід зазначити, проте, що саме залежність хімічного зрушення від поля ускладнює порівняння спектрів, знятих при різних значеннях напруженості магнітного поля.




Рис.2.2. Випадок слабкого і сильного зв'язку для системи двохспіну АХ (I = 1/2), яка переходить в систему АВ за рахунок зменшення різниці хімічних зрушень  Величина константи непрямої спін-спінової взаємодії JAX залишається незмінною (JAX ~ 10 Гц). Зверху вниз: J = 0, 0,5, 1,2,5, 10 і 20.

Константи скалярної взаємодії і структура молекул

Непряма взаємодія двох ядерних спинів здійснюється через електрони зв'язку. У першому наближенні можна відзначити, що величина цієї взаємодії убуває із зростанням числа зв'язків між ядрами. З аналізу мультиплетності резонансних ліній можна спробувати побудувати альтернативну структуру для невідомої речовини і навіть вибрати найбільш вірогідну просторову структуру.

Строго кажучи, константа спін-спінової взаємодії J визначається не тільки числом зв'язків між взаємодіючими ядрами, але також залежить від особливостей просторового розподілу електронів. Оскільки просторовий розподіл електронів у свою чергу залежить від діедрального кута Θ, тобто кута на який повернено один щодо одного дві сусідні групи ядерних спинів, зв'язані між собою непрямою спін-спіновою взаємодією, то і константа J залежить від кута Θ. Внаслідок цього навіть якщо число зв'язків між взаємодіючими спинами невелике, константа непрямої спін-спінової взаємодії у ряді випадків зменшується до нуля. Надалі переконаємося, що наявність залежності константи J від кута Θ дає можливість вирішувати достатньо складні завдання структурної хімії. Це, зокрема, дозволило визначити структуру такої складної молекули, як протеїн.

Визначення партнера по взаємодії

Інформація про хімічну структуру молекули може бути отримана після того, як визначено, які з ядер даної молекули зв'язані між собою скалярною спін-спіновою взаємодією. Величина цієї взаємо­дії дозволяє зробити вивід про те, які з ядер є сусідніми в даній хімічній структурі.

У розглянутому раніше простому спектрі етанолу видно, що CH2- і CH3группи є сусідами одна з іншою. У складнішому спектрі ЯМР, що складається з великого числа ліній, достатньо складно зробити вивід про те, які з взаємодій викликають спостережуване розщеплювання спектральних ліній. В цьому випадку прагнуть спростити спектр, застосовуючи метод подвійного резонансу або розв'язку. Якщо в процесі детектування на систему взаємодіючих спинів подається ще одне РЧ поле, що впливає селективно на резонансній частоті одного з ядерних спинів, наприклад А, те мультиплетна структура резонансної лінії, відповідної спину ядра X, за умови, що розщеплювання цієї лінії обумовлене спін-спіновим зв'язком між спинами А і X, зникає. Для етанолу розв'язка на частоті, відповідній метиленовим протонам, приводить до зникнення розщеплювання в метильній групі. На рис.2.3 приведена схема проведення цього експерименту. Одночасно із збуджуючим імпульсом (поле B1) додатково подається імпульс другого РЧ поля B2 що впливає на частоті 2 протягом збору даних. Для ефективної розв'язки величина поля B2 повинна задовольняти умові γB2 > > 2J. Очевидно, що напруженість поля розв'язки повинна перевищувати напруженість поля, що створюється збудженим спином. У гетероядерному випадку при проведенні цього експерименту не виникає яких-небудь додаткових проблем, оскільки різниця значень частот збуджуючого поля і поля розв'язки достатньо велика. У гомоядерному випадку при безперервному опромінюванні полемо B2 виникають складнощі з реєстрацією слабкого сигналу ЯМР, оскільки важко уникнути дії поля розв'язки на приймач, налаштований на частоту сигналу, що детектується. Тому систему спину опромінюють другою частотою не безперервно, а в імпульсному режимі, причому це опромінювання синхронізоване із збором даних (див. рис.2.3). Під час дії імпульсу канал приймача залишається закритим, збір даних здійснюється під час інтервалу між імпульсами (режим розділення часу), тому під час збору даних значних спотворень не виникає. Не дивлячись на те що опромінювання проводиться полем B2 з напруженістю, усередненою по всьому циклу, приведена вище умова виконується.

Цю ж інформацію для всіх партнерів по спін-спіновій взаємодії можна отримати з одного експерименту - двовимірного ЯМР-експерімента, що вимагає проте, значних витрат часу. Щодо великих молекул, для аналізу структури яких необхідно визначити велике число констант спін-спінової взаємодії, така витрата часу цілком виправдана і, без­умовно, компенсується отримуваними результатами. Відзначимо, що існує велике число варіантів експериментів з розв'язкою, які можуть дати повнішу інформацію, проте використовуються при вирішенні спеціальних завдань. Серед них можна відмітити "спін-тіклінг". Цей метод не спрощує спектр, а навпаки, приводить до виникнення нових ліній - так званих артефактів, які з'являються в тому випадку, якщо при розв'язці потужність РЧ поля вибирається дуже малою.

У гетероядерному випадку такі експерименти часто направлені не на спрощення спектрів, а на отримання інформації про непряму спін-спіно­ву взаємодію, оскільки розв'язка приводить до повного зникнення мультиплетної структури ліній. З цією метою поле розв'язки впливає не селективно, на певній частоті, а в смузі частот. Такий варіант розв'язки називається широкосмуговою розв'язкою. Даний метод можна реа­лизувати просто за допомогою швидкої модуляції високою частотою, подібно до того, як це проводиться в стандартному методі шумової розв'язки. Ефективніші сучасні імпульсні методи (WALTZ, MLEV), які дозволяють проводити розв'язку в достатньо широкій області частот і безпосередньо враховують властивості ядерних спинів.

Проте при використанні широкосмугової розв'язки виникає про­блема, що полягає в тому, що зразок піддається опромінюванню додатковим полемо протягом достатнього тривалого часу. Це особливо сильно позначається на водних розчинах і розчинах електролітів, які доста­тньо сильно поглинають РЧ випромінювання, що приводить до розігрівання зразка. Зміна температури позначається на виді спектру in-vitro, а для чутливих до зміни температури біологічних молекул може приво­дить до необоротної денатурації. При проведенні досліджень in-vivo це може привести до потенційно шкідливішої дії, а саме, руйнівному перегріву тканин.





Ріс.2.3. Експеримент з розв'язкою від непрямої спін-спінової взаємодії. Безперервна розв'язка (а) і розв'язка розділення часу (b). Амплітуда імпульсу, що взаємодіє на частоті 1, використовуваного для реєстрації, зазвичай багато більше амплітуди імпульсу розв'язки, що впливає на частоті 2. Згідно теорії, поле 1 повинне включатися одночасно з полем 2. Для того, щоб компенсувати наведення, що виникають при включенні поля розв'язки, це поле включається вже перед включенням детектуючого імпульсу. Приймач включається із затримкою в порівнянні з включенням імпульсу на частоті 1, тому спад сигналу після дії цього імпульсу може бути повним.


Процеси, залежні від часу в ЯМР

Процеси релаксації спіну за рахунок модуляції в часі різ­них взаємодій – характерний, але далеко не єдиний приклад явищ, які можуть бути вивчені методом ЯМР. Ці процеси в шкалі часу ЯМР часто характеризуються або дуже малим, або дуже великим часом. Поняття шкали часу засноване на простій концепції, яка знаходить застосування в багатьох областях. Якщо мова йде про повільні процеси, то передбачається, що він може бути описаний послідовно, на кожному з етапів. При розгляді швидкого процесу передбачається, що спостерігаємо за якоюсь усередненою поведінкою системи. Тут необхідно відразу ж пояснити, що поняття повільних і швидких процесів вводиться лише тоді, коли приводиться шкала часу, в якій проводиться розгляд.

Простий шлях полягає в тому, щоб задати граничні значення часів, і в цьому випадку всі фізичні явища описувати як швидкі або повільні в порівнянні з цими значеннями. Очевидно, що часи, які задають масштаб, залежать також і від того, які фізичні процеси описуються в даному наближенні. При цьому існує не одна тимчасова шкала ЯМР, а безліч різних шкал залежно від типу взаємодій, що розглядаються. З теоретичної точки зору найбільш складною для обговорення є проміжна область, в якій не реалізуються 2 граничних випадку: швидких і повільних процесів. Незалежно від використовуваної шкали ЯМР фізичні процеси, пов'язані з різними рухами, мають свою власну шкалу часу, яка може бути описана часом кореляції або характеристичними частотами. У табл.2.4 представлені типові інтервали частот для основних молекулярних рухів: від дуже повільних - з характеристичними часом від декількох хвилин до декількох годин до дуже швидких - в пікосекундній області. Існують різноманітні резонансні методи, дозволяючі реєструвати процеси, що протікають з характерними часом до 10 пс. Тільки такі надшвидкі процеси, як торсіонні і вібраційні рухи атомів, не піддаються прямому спостереженню за допомогою методів ЯМР. Крім того існують макроскопічні рухи: потоки рідин і м'язові скорочення. Ці процеси грають другорядну роль в спектроскопії in-vitro, орієнтованою на біохімічні проблеми, од­нак в ЯМР-томографії і в in-vivo-спектроскопії роль таких процесів достатньо велика. Таким чином, характерні часи процесів, які реєст­руються з допомогою ЯМР, потрапляють в широку область, що охоплює декілька порядків на тимчасовій шкалі, при цьому кожен з ЯМР-експеріментів характеризується певною тимчасовою областю, яка відповідає досліджуваним процесам.

Таблиця 2.4. Характерні значення частот молекулярних рухів



Тип руху

область значень частот (с-1)

Вібраційні і торсіонні рухи

1010–1013

Латеральна дифузія в мембранах

107–1010

Дифузія в розчинах

106–1013

Обертальна дифузія в розчинах

105–1012

Обертання аліфатичних бічних ланцюгів в молекулах

107–1010

Обертання ароматичних бічних ланцюгів в молекулах

10-2– 106

Конформаційні зміни протеїнів

10-5–105

Вивільнення субстратів при ферментативних реакціях

10-3–106

Електронним парамагнітним резонансом є явище поглинання випромінювання мікрохвильової частоти молекулами, іонами або атомами, що мають електрони з неспареними спинами, . Метод спектроскопії ЕПР, що є одним з досить широко вживаних і продуктивних фізичних методів структурних і кінетичних досліджень в хімії, застосовний тільки до парамагнітних зразків. До таких зразків відносяться частинки, що мають неспарені електрони, – вільні радикали, іон-радикали, молекули в триплетних станах, комплекси перехідних металів і ін., а також фази, що містять вільні електрони і інші парамагнітні центри.

Застосування методів спектроскопії ЕПР в хімічних дослідженнях вельми різноманітно. Але чітко можна говорити про два напрями – один, що стосується в основному структурних аспектів, і інший – динаміки процесів. До першого відноситься вивчення структури органічних, неорганічних і комплексних радикалів і іон-радикалів, парамагнітних центрів в твердих тілах і т. д., а до другого – вивчення механізмів і кінетики хімічних реакцій, обмінних процесів і так далі .

  1   2


База даних захищена авторським правом ©lecture.in.ua 2016
звернутися до адміністрації

    Головна сторінка