Курс за вибором: “Сучасні проблеми молекулярної біології” Лекція 1



Скачати 470.79 Kb.
Сторінка8/8
Дата конвертації09.11.2016
Розмір470.79 Kb.
1   2   3   4   5   6   7   8

3) ферментні системи, які діють безпосередньо на рівні генетичних структур, тобто «виправляють» пошкоджені мутагеном ділянки хромосоми. Мутаційний ефект може бути також знятий фізичним ивпливами певної інтенсивності (світлом, високою і низькою температурою та ін.)



Курс за вибором: “Сучасні проблеми молекулярної біології”


Для студентів ІІ курсу фармацевтичного факультету

Лекція №5

ТЕМА: «МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ НУКЛЕЇНОВИХ КИСЛОТ. РЕКОМБІНАНТНІ ДНК»

ПЛАН:


  1. Визначення технологій рекомбінантних ДНК

  2. ДНК-тестування
    1. Пряме генне тестування та його обмеження

    2. Методи вивчення нуклеїнових кислот


    3. Джерела отримання генетичного матеріалу для ДНК-діагностики

    4. Пряме генне тестування. Крок 1: Рестрикція (розрізання) ДНК

    5. Створення рекомбинантних ДНК

    6. Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР або PCR)

    7. Крок 2:ДНК-електрофорез з гелем

    8. КРОК 3: ДНК- гібридизація

    9. FISH – аналіз

    10. Саузерн-Блоттінг (Southern Blot Analysis)

    11. Секвенування ДНК і виявлення генетичних хвороб
    12. Непряме генне тестування


  3. Метод генетичних відбитків пальців (genetic fingerprinting)

  4. Вестерн-Блоттінг (Western Blot Analysis)

  5. Нозерн-Блоттинг (Northern Blot Analysis)
    1. Практичне застосування ДНК-технологій


  6. Прогностичне генетичне тестування




  1. Визначення технологій рекомбінантних ДНК

Технології рекомбінантних ДНК - сукупність експериментальних технік, які дозволяють ізолювати, копіювати та вводити нові послідовності ДНК у клітини хазяїна-реципієнта за допомогою ряду лабораторних протоколів та методологій.

  1. ДНК-тестування

може залучати аналіз гена безпосередньо (пряме тестування гена) або коротких сегментів ДНК, розташованих близько або у межах гена (непряме дослідження гена).

    1. Пряме генне тестування та його обмеження

доводить присутність або відсутність певної мутації гена через дослідження послідовності нуклеотидів у гені.

Цей тест є дуже точним і використовується для діагнистики і скринінгу, зокрема передродового, тестування та скринінгу носіїв патологічного гену, пресимптоматичного і попреджувального тестування.

Обмеження включають:

– Інтерпретація результату тесту, наприклад, віднайдення пошкодженого гену, не завжди вказує на те, як саме людина є або буде вражена певним хворобливим станом.

– Тестування може віднімати багато часу і є дорогим для системи охорони здоров'я або для пацієнта

Для деяких складних станів, як, наприклад, раку, тестування може бути зроблене для членів сім’ї, щоб ідентифікувати певну сімейну мутацію гену (пошук мутації) перед тим, як здоровим членам сім'ї може бути запропоноване попреджувальне тестування.

  1. Методи вивчення нуклеїнових кислот:

Секвенування ДНК -це розпізнання послідовності основ ДНК

Клонування ДНК - розмноження окремих фрагментів ДНК

Зворотна транскрипція - отримання певних фрагментів ДНК (зондів ДНК) на основі зворотної транскрипції з мРНК

Метод гібридизації – з’єднується ДНК різних геномів шляхом генної інженерії

FISH – аналіз – флуоресцентна гибридізація in situ.

3.1 Джерела отримання генетичного матеріалу для ДНК-діагностики

ДНК для тестування може бути екстрактована з клітин різноманітних рідин біологічного походження або тканин.

Більшість тестів здійснюються з використанням ДНК клітин крові. Джерелами ДНК також можуть бути клітини, одержані з букального епітелію щоки за допомогою зубної щітки, або клітини волосяного фолікулу.

3.2 Пряме генне тестування. Крок 1: Рестрикція (розрізання) ДНК

Вчені використовували рестрикційне картування у молекулярній біології з 40 - 50 років минулого століття, щоб проаналізувати структуру і послідовність молекул ДНК. Ця потужна методика залучає використання рестрикційного (обмежувального) травлення.

Рестрикційне травлення - процес розрізання молекул ДНК на менші фрагменти за допомогою спеціальних ферментів рестрикційних ендонуклеаз (які ще іноді називаються рестрикційними ферментами, RE або РЕ).

РЕ визначають певні послідовності ДНК, де б вони не розташовувались у геномі, зазвичай у 4-8 пар нуклеотидів довжиною (наприклад, GATATC), і роз’єднують ці послідовності.

Як ДНК кожної особи має певну невелику різницю так і сайти (місця) рестрикції можуть знаходитись у різних місцях некодуючої ДНК людей. І ферменти виріжуть ДНК різних розмірів у різних пацієнтів.

Досьогодні ізольовано більш 900 рестрикційних ферментів, деякі – зі специфічними послідовностями, а деякі – ні, з більше як 230 штамів бактерій.

Є три класи рестрикційних ферментів (тип І, II і III). Найчастіше використовуються ферменти II типу. Вони визначають певні послідовності у 4, 5, чи 6 нуклеотидів довжиною і мають подвійну симетрію.

Розпізнавана ферментом ІІ-го типу послідовність у багатьох сайтах рестрикції є однаковою на обох ланцюгах ДНК. Такі послідовності називаються паліндромними.

3.3.Створення рекомбінантних ДНК

Деякі ферменти розрізають обидва ланцюги точно по осі симетрії, утворюючи фрагменти ДНК, які мають тупі або рівні кінці (наприклад EcoRV); інші роз’єднують кожен ланцюг у подібних місцях на протилежних боках осі симетрії, створюючи фрагменти ДНК, що мають виступаючі одноланцюгові кінці (вони також називаються «липкі» кінці або виступи).

Рестрикційні ферменти і фрагменти, що ними продукуються, стали потужним інструментом молекулярної генетики.

Вони використовуються:

для картування молекул ДНК

щоб проаналізувати поліморфізм популяції

щоб перекомбіновувати молекули ДНК

щоб створювати молекулярні проби

щоб створити мутантів (химерні організми)

щоб проаналізувати модифікаційний статус ДНК та у ін. напрямках

3.4. Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР або PCR)

експериментальний метод молекулярної біології, спосіб значного збільшення малих концентрацій бажаних фрагментів ДНК у біологічному матеріалі (пробі).

Крім простого збільшення числа копій ДНК (цей процес називається ампліфікацією), ПЛР дозволяє проводити введення мутацій, зрощення фрагментів ДНК, клонування генів, виділення нових генів, секвенування, створення генетично модіфікованих організмів, проводити діагностику захворювань (спадкових, інфекційних), ідентифікацію малих кількостей ДНК, встановлення батьківства.

3.5.Крок 2:ДНК-електрофорез з гелем

Гель-електрофорез – це техніка, використовувана для розділення нуклеїнових кислот і білків.

Відрізок ДНК розміщується у шарі ‘желе’ (гелевидна матриця) і електричний потік застосовується таким чином, що ‘желе’ стає електризованим, набуває ‘позитивного’ (+) заряду вгорі і негативного (-) заряду унизу - точно так само як позитивні і негативні полюси батареї.

Оскільки ДНК – хімічна структура, що має негативний заряд, фрагменти ДНК рухаються у напрямку позитивного полюсу гелю або від вершини до низу.

Відрізки ДНК розташовуються у гелі відповідно до розміру: найбільші фрагменти переміщаються найповільніше і тому розташовуються найближче до вершині гелю. Гель зараз містить всю ДНК особи, розташовану від вершини до низу гелю.

Фрикційна сила гелевих матеріалів працює як "Молекулярне сито", відокремлюючи молекули за розміром. Рівень їх міграції через електричне поле залежить від сили поля, розміру і форми молекул, відносної гідрофобності зразків, і від іонної сили і температури буфера, у якому молекули рухаються.

Після фарбування, відокремлені макромолекули у кожній вузькій доріжці можуть бути видні як серії смуг від одного кінця гелю до іншого.

3.6 КРОК 3: ДНК- гібридизація. FISH – аналіз

флуоресцентна гібридизація по місцю (fluorescence in situ hybridization)

1. Заснований на реакції гібридизації різних флуоресцентних мічених зондів ДНК, які з'єднуються із визначеними локусами хромосом

2. Метод дозволяє виявити геномні, хромосомні аберації, генні мутації у клітинах ембріона

Створення використовуваних для дослідження проб важке. Воно може бути дорогим, а процес займає певний час.

Нещодавно був розроблений швидший метод для діагностики генетичних станів, які пов’язані із делеціями або дуплікаціями певних генів у формі мікроматриці.

ДНК досліджуваної особи, накладається на дуже малу поверхню, де розміщаються тисячі різних проб, які являють собою тисячі областей ДНК або генів. Побудовані мікроматриці можуть бути специфічними для однієї хромосоми або включають всю ДНК людської клітини (геном).

Тут є дві копії кожного гена (див. рис). В даному випадку

Особа А має дві пошкоджені копії гена і, можливо, має певний генетичний стан

Особа В має одну пошкоджену копію, а інша - працює. Тому це носій пошкодженого гена

Особа С має обидні копії цього гена з нормальною функцією гена.

3.7 Саузерн-Блоттінг (Southern Blot Analysis)

метод ідентифікації специфічних форм ДНК у клітинах. Молекули ДНК видаляються з клітин і за допомогою рестриктаз розділяються на невеликі фрагменти. Ці фрагменти відділяються один від одного, і за допомогою генного зонда проводиться пошук ідентичних ділянок ДНК.

3.8. Секвенування ДНК і виявлення генетичних хвороб

Як тільки створений зразок, в якому всі молекули походять від єдиної ділянки ДНК, можливо здійснити секвенування (встановлення послідовності) ДНК для визначення невідомої послідовності нуклеотидів певного фрагменту між двома праймерами.

  1. Непряме генне тестування

Це порівняння ДНК-маркерів членів сім'ї із станом маркерів у неуражених хворобою родичів.

Використовується у ситуаціях, де безпосередній локус гена не був точно встановлений або, у випадках, де мутація(ї) у гені ще не були визначені;

Тест не є таким точним як пряме генне тестування, але може використовуватися у діагностиці, включаючи передродову і пре-симптоматичну і попереднє тестування.

Обмеження включають:

Не завжди можна знайти маркери ДНК, які надають можливість ученим встановити різницю між помилковою копією гена і робочою копією гена

У цьому методі генетичного тестування, вчені використовують той факт, що спеціальні сегменти ДНК знаходяться в безпосередній близькості від гена на хромосомі. Ці сегменти майже завжди зчеплені із геном, коли він передається від батьків до дітей: з більшою ймовірністю, якщо вони ближчі до гена. Ці сегменти ДНК називаються «поліморфними маркерами». Ці маркери є різними у різних сім'ях. Це трохи схоже на сигнальні вогні, які показують, що робоча або пошкоджена копії генів знаходяться поблизу на хромосомі. Чим тісніше маркер зчеплений з геном, тим вчені більш певні, що поряд знаходяться пошкоджена або робоча копії генів. Цей метод непрямого генного тестування називається «метод зчеплення». Маркери, які пов'язані з несправною або робочою копіями генів є особливими для кожної родини, тому цей метод генетичного тестування може бути виконаний тільки у межах сім'ї. Непряме дослідження генів є "родинним тестом ".


  1. Метод генетичних відбитків пальців (genetic fingerprinting)

— метод, що використовується в криміналістиці для ідентифікації людини, при порівнянні її ДНК з ДНК у наданому зразку. ПЛР звичайно використовувається для ампліфікації набору певних ділянок ДНК, змінних у людей. Комбінація довжин всіх цих ділянок, які потім розділяються за допомогою гелевого електрофорезу, створює «генетичний відбиток пальців».

Із застосуванням ПЛР теоретично потрібна лише одна молекула ДНК для певної ідентифікації, хоча у окремих випадках саме ця чутливіть збільшує ризик помилок через можливе забруднення, і ампліфікацію в результаті ДНК з зовнішніх джерел.

Існує кілька методів генетичних відбитків пільців, але всі воні зазвичай використовують гелевий електрофорез, після чого зразок фарбується за допомогою етідіум броміда або інших фарбників, або спостерігається за допомогою гібридизації з пробами ДНК за допомогою саузерн-блоттінга.

На практиці необхідний зразок генетичного матеріалу збирається з місця злочину — кров, слина, сперма, волосся тощо. Цей зразок порівнюють з генетичним матеріалом підозрюваного. Оскільки є невелика вірогідність, що у двох людей відбитки виявляться схожими, цей метод частіше використовується для доказу невинності підозрюваного.

Хоча «генетичні відбитки пальців» унікальні (за виключенням випадку однояйцевих близнят), споріднені зв'язки все ж таки можна встановити, зробивши декілька таких відбитків. Той же метод можна застосовувати, злегка модифікувавши його, для встановлення еволюційної спорідненості серед організмів.

  1. Вестерн-Блоттінг (Western Blot Analysis)

метод виявлення деяких білків. Після їх відділення за допомогою електрофорезу, білки з'єднуються з міченими радіоактивною речовиною антитілами і ідентифікуються при рентгенологічному дослідженні.

  1. Нозерн-Блоттинг (Northern Blot Analysis)

метод визначення специфічних ділянок інформаційної (матричної) РНК у клітинах. Він заснований на використанні генного зонда, призначеного для виявлення певної РНК.

8. Практичне застосування ДНК-технологій

1. Медичне: хвороба часто включає зміни у експресії гена, тому методи ДНК:

- допомогають встановити пошкоджений ген.

- Діагностувати хворобу/інфекцію: ПЛР та мічені ДНК-проби від хвороботворних організмів можуть допомогти ідентифікувати типи мікроба за допомогою рестрикційного аналізу довжини фрагментів (Restriction Fragment Length Analysis (RFLP)), коли маркери часто успадковуються разом із хворобою.

- Аналізувати фрагменти ДНК (ДНК-відбитки пальців) для встановлення батьківства

2. Генна терапія: ідея замінювати дефектні гени через мікроін'єкцію ДНК вимагає векторів, які створюються за допомогою ДНК-методів.

3.Фармацевтичне: створення ліків

9. Прогностичне генетичне тестування

Іноді виявлення пошкодженого гена означає для пацієнта збільшену оцінку ризику виникнення захворювання, а не повну упевненість, що це захворювання розвиватиметься у людини пізніше у житті. Цей вид прямого генного тестування називається прогнозуючим.

Прогнозуюче тестування можливе у деяких родинних випадках, як наприклад, якщо серед родичів є успадкована схильність до гемодисхромії (коли солі заліза відкладаються у тканині) або до раку грудей.

Дякую за увагу!

DNA chips can reveal DNA mutations and RNA expression

There are a large number of genes in eukaryotic genomes.

· The pattern of expression between different tissues and at different times is quite distinctive.

· Cells have unique mRNA's.

· For example, early stage skin cancer have a unique mRNA "fingerprint".

· To find these patterns, DNA sequences can be arranged in an array on a solid support.

· DNA chip technology provides these large arrays.

Merging DNA technology with the manufacturing technology of the semiconductor industry, large arrays are being produced.

· DNA chips are glass slides onto which DNA sequences are attached in precise order.

· The typical slide is divided into 24x24 uM squares. Each contains about 10 million copies of a particular sequence, which is up to 20 nucleotides long.

· A computer controls the additions of the nucleotides in predetermined pattern.

· Up to 60,000 different sequences can be put on a single chip.

· Cellular mRNA is isolated from cells and is used to make complementary DNA, which is called cDNA.

· Reverse transcriptase and PCR are used together in a process called RT-PCR.

· The amplified cDNA is coupled to a fluorescent dye. It is then hybridized to the chip.

· A sensitive scanner detects the spots on the array that glow. The combinations of spots that light up differ with different types of cells or different physiological states.

· DNA chip technology can be used in detecting genetic variants.

· Twenty-nucleotide fragments of DNA sequences of all possible mutations are arranged.

· The person's DNA is hybridized to determine if any hybridize to a mutant sequence on the chip.

Detection of a Gene

Locating a gene (or its activity) - Restriction Maps.

1. Restriction maps... via gel electrophoresis &DNA-electropherogram

2. DNA fingerprintg. CSI Miami - how to make one: a murder case&a rape case + DNA prints in Health & Society& DNA Forensic Science

3. DNA Probe Hybridizationg - to detect specific DNA with a probe

4. Comparing Restriction Fragments to a probe:

Southerng Blotting - DNA electrophoresis & blotting one can detect specific gene sequence in samples by binding to labeled probes

5. DNA micro-arrays - monitor gene expression in thousands of genes & changes by passing cDNA of the cell's mRNA over slide with ssDNA of all cell's genes;

DNA microchips are fabricated by high speed robotics akin to Intel chip making

DNA (mRNA's) are fluorescently tagged so easy to see in slide's wells [microchips arrays made simultaneously by phopshoramidite method of Caruthers].

5. Gene Sequencing strategy - random fragments are sequenced and then ordered relative to each other via overlap & supercomputing

1 Sequencing Strategies methodology dideoxy procedure (development by Fred Sanger)

1   2   3   4   5   6   7   8


База даних захищена авторським правом ©lecture.in.ua 2016
звернутися до адміністрації

    Головна сторінка